miR-103对牙髓干细胞增殖及其向成牙本质细胞分化的影响

李凤月 齐洪光 于登臣 袁佳运 侯宝华

牙髓再生、自体牙再造等再生医学研究在牙体牙髓病领域中得到了广泛关注，而作为“种子细胞”的牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)成为近年来的研究热点[1-2]。目前,对DPSCs增殖、分化等生物学特性的调控机制尚不完全清楚，牙体牙髓领域的再生医学研究仍处于初级阶段[3]。因此，深入研究DPSCs的增殖与分化等生物学行为的调控机制具有重要意义。近年来， miR-103对DPSCs的作用尚不清楚。本研究通过从成人第三磨牙中分离培养DPSCs，利用转染技术在DPSCs中过表达及降低miR-103的含量，继而检测miR-103对DPSCs增殖及分化的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

澳洲胎牛血清、低糖的DMEM细胞培养基、I型胶原及双抗等细胞培养试剂(Gibco公司，美国)；转染试剂lipo2000(Invitrogen公司，美国)；miRNA核苷酸序列(南京舟达公司)；q-PCR试剂套装(RNA的提纯、反转录及扩增试剂盒)(Takara公司，日本)；q-PCR引物(上海生工生物公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天公司)；Runx2和Osx等抗体(Abcam公司，英国)；茜素红、地塞米松、维生素C和磷酸甘油(Sigma公司，美国)；细胞培养瓶、培养皿及离心管(Corning公司，美国)； 实时荧光定量PCR仪(ABI7500fast,Applied Biosystems公司，美国)；酶标仪(SPS5845,上海沛欧分析仪器有限公司)；显微镜(cx21fs1,Olympus公司，日本)；电泳仪(天能EPS600, 上海天能公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 从成人第三磨牙中分离DPSCs，方法如下：所用牙齿均来自因阻生或因正畸治疗需要而拔出的健康第三磨牙。第三磨牙拔出后进行彻底消毒，用含有青霉素及链霉素的清洗液浸泡后用环钻劈开，无菌条件下取出牙髓组织，并将上述组织修剪成约1 mm3的组织块，用I型胶原酶完全覆盖消化组织，短暂反应后，将消化后的组织块置于培养瓶中培养，将培养瓶置于常规孵箱中培养，隔天置换培养基，待DPSCs从组织块中爬出。待细胞融合率在70%左右时进行细胞传代，取3～8 代的细胞用于实验[4]。

利用lipo2000将公司合成的80 nmol/L的miRNA相关核苷酸序列转染进DPSCs。本实验根据转染入细胞的核苷酸序列不同，将细胞分为对照组(Control)、miRNA阴性对照组(miR-NC)、miR-103过表达组(miR-mimic)和miR-103降低表达组(anti-miR)[5]。

1.2.2 茜素红染色 完成细胞转染后，利用75%乙醇固定培养皿中的DPSCs，利用双蒸水冲洗细胞3 次，每孔加入40 mmol/L的茜素红染料浸没，染色10 min后清洗染料，并再次利用双蒸水缓慢冲洗培养皿，在培养皿中加入缓冲液后继续室温孵育， 30 min后观察红色的矿化结节。采用梯度稀释法制作茜素红-吸光度标准曲线，进行半定量检测[6]。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 转染效率检测

在利用合成的核苷酸转染细胞后，利用q-PCR技术检测每组细胞miR-103的含量变化，验证转染效率。和miR-NC 相比，miR-mimic组miR-103含量大幅增加(P<0.05)，而anti-miR细胞miR-103含量显著下降(P<0.05)；和Control相比，miR-NC组细胞内miR-103含量未发生明显变化(P>0.05)(图 1)。

图 1 q-PCR技术检测转染后各组细胞内miR-103的含量 图 2 CCK-8法检测各组细胞的增殖能力

2.2 miR-103抑制DPSCs的增殖

验证转染效率后，利用CCK-8法检测各组细胞的增殖能力如图 2，和miR-NC 相比，miR-mimic组DPSCs的增殖能力减弱(P<0.05)，而anti-miR组DPSCs的增殖能力增强(P<0.05)；和Control相比，miR-NC组DPSCs的增殖能力未发生明显变化(P>0.05)。

2.3 miR-103降低Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量

利用q-PCR技术检测各组细胞中Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量变化如图 3，和miR-NC 相比，miR-mimic组Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量减少(P<0.05)，而anti-miR细胞Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC组细胞内Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量未发生明显变化(P>0.05)。

图 3 q-PCR技术检测各组细胞中Runx2, Osx和ALP等分化指标的mRNA含量变化

2.4 miR-103降低Runx2和Osx蛋白的表达

利用Western blot技术检测各组细胞中Runx2和Osx等分化指标蛋白的表达如图 4，和miR-NC 相比，miR-mimic组Runx2和Osx等分化指标蛋白的表达减少(P<0.05)，而anti-miR细胞Runx2和Osx等分化指标蛋白的表达增加(P<0.05)；和Control相比，miR-NC组细胞内Runx2和Osx等分化指标蛋白的表达未发生明显变化(P>0.05)。

图 4 Western blot技术检测各组细胞中Runx2和Osx等分化指标蛋白的表达

2.5 miR-103抑制DPSCs矿化结节的形成

利用茜素红染色的方法检测各组细胞的矿化能力如图 5，和miR-NC相比， miR-mimic组矿化能力减弱(P<0.05)，而anti-miR组矿化能力增强(P<0.05)；和Control相比，miR-NC组矿化能力未发生明显变化(P>0.05)。

图 5 茜素红检测各组细胞的矿化能力

3 讨 论

牙髓牙体疾病在口腔疾病中发病率较高，而就诊的患者中有很大一部分的牙体牙髓已经发生了不可逆的损伤，往往只能通过去除病变的牙体及牙髓的手段治疗，达到症状缓解及恢复功能的目的[7]。而随着组织工程技术的飞快发展，再生医学在牙体牙髓研究领域也成为研究热点。DPSCs是极具临床应用潜力的间充质干细胞，当牙髓组织受到损伤后DPSCs根据损伤情况，在精密的网络调控下分化，修复损伤的牙髓组织或牙本质[8]。而DPSCs增殖与分化等生物学行为的调控机制非常复杂，尚未完全阐明。

文献综述后发现miR-103在骨髓间充质干细胞分化调控及成骨细胞增殖调控中具有重要作用[5，9]，为验证miR-103对DPSCs增殖和分化的调控作用，研究利用细胞转染核苷酸片段的技术体外成功过表达和降低表达miR-103。随后发现过表达miR-103抑制DPSCs增殖，这与之前学者报道一致。Sun等[5]证实miR-103能够通过作用于钙离子通道关键蛋白Cav1.2抑制成骨细胞的增殖。Liao等[10]发现miR-103通过直接靶向周期相关蛋白CCNE1和CDK2抑制小鼠肠道细胞的增殖。还有学者证明miR-103在乳腺癌细胞中高表达，并在其增殖等生物学行为中发挥重要调控作用[11]。

随后还验证了miR-103对DPSCs内Runx2, Osx和ALP等分化指标表达的影响。Osx也是骨形成调控过程中不可缺少的成骨细胞特异性转录因子，缺少Osx会引起DPSCs向成牙本质细胞的分化障碍[6]。在本实验中，发现miR-103过表达抑制了DPSCs向成牙本质细胞的分化。为了进一步验证miR-103抑制DPSCs向成牙本质细胞的分化，利用茜素红染色检测了miR-103对DPSCs矿化能力的影响，发现miR-103过表达抑制了DPSCs向成牙本质细胞的分化，并最终抑制了DPSCs的矿化作用。这和之前报道一致，Zuo等[9]发现miR-103能够通过靶向作用Runx2在细胞水平和动物水平抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化和矿化能力。

综上所述，miR-103能够抑制DPSCs的增殖能力，并抑制DPSCs向成牙本质细胞的分化。本实验探讨了miR-103对DPSCs增殖和分化的影响，但miR-103对DPSCs增殖和分化的调控机制仍有待进一步研究与探索。