细胞外囊泡的生物学功能及其临床应用

张赵一淳 郭静 综述 邱新毓 冯剑颖 审校

1 细胞外囊泡

细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是指细胞分泌的各种类型的膜囊泡，电镜下EVs为杯状或球形的双层脂质膜结构，其内包含了许多不同种类的生物活性分子，比如蛋白质、DNA、RNA、长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)和脂质等[1]。包括免疫细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)和血细胞等在内的各种细胞均能够分泌EVs，使其广泛地分布于血液、尿液、乳汁等各类体液中，从而发挥特定的生物学功能。目前EVs的分类方式有很多，根据目前对细胞外囊泡生物起源的了解，其大致可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体三大类。外泌体一般直径大小在50～150 nm，来源于细胞的胞内体，而微囊泡直径大小在50～500 nm，甚至会达到1 μm，一般来自细胞膜[2]。而凋亡小体一般由细胞发生凋亡后产生，直径约在1～5 μm左右。

作为生命体进化过程中一个十分保守的环节，EVs的分泌起初被认为是发挥着清除细胞内不必要物质的作用。随着研究技术手段的不断革新，越来越多的研究发现，EVs作为细胞间彼此相互沟通的桥梁，能够参加细胞间的多种信号传导。同时，通过运输不同种类的生物分子，EVs还能够实现细胞之间的成分交换，介导细胞各种各样的生理与病理过程[2]。

2 EVs的生物学功能及其临床诊疗作用

目前研究表明，EVs是由母细胞在炎症、缺氧、氧化应激、衰老和细胞凋亡等不同因素影响下构成或激活后产生的[1]。EVs内容物种类主要取决于母细胞的类型和分化程度及所处微环境的刺激因素，其内含物包括脂质(如类花生酸)、蛋白质(如细胞因子、趋化因子、生长因子或其他信号转导中介体)、遗传物质(如mRNAs、lncRNAs)和在大囊泡中包含的整个细胞器结构(如线粒体等)[1-2]。EVs在特定条件下与受体细胞相互作用后，释放其内容物，从而发挥相应的生物学功能。虽然介导EVs作用于受体细胞的具体机制目前仍不十分清楚，但已有部分研究证实，EVs能够参与细胞的绝大多数生理病理过程，包括信号转导、细胞生长及发育、代谢调节、组织稳态与修复再生、抗原呈递与免疫应答等等[1,3-5]。

2.1 EVs的形成过程

EVs形成过程中的不同步骤涉及多种分选机制[2]。首先，脂质和膜相关蛋白在细胞膜(形成微囊泡)和多囊泡核内体(multivesicular endosome， MVE)的有限膜区域(形成外泌体)中聚集，这些区域一般被称为分散的微域。随后，这些微域参与可溶性成分(比如胞质内蛋白质和不同RNA)的募集，而这些可溶性成分要在EVs中进行分选。集群的微域形成与外加的机械作用共同促进细胞膜出芽的过程，随后出现质膜向细胞外介质或MVE的限制膜向MVE腔的分裂过程。在外泌体和微囊泡分选的跨膜蛋白仍然保持在质膜上同样的拓扑学结构。目前，外泌体形成的机制已经较为明确，其中涉及到运输所需的内体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport， ESCRT)的亚单位具有十分重要的作用。在管腔内囊泡(Intraluminal vesicles， ILVs)进入MVE腔内时，在不同程度上需要ESCRT-III的参与，而内含物的聚集和膜出芽的过程则不完全依赖于ESCRT[6-7]。相较于外泌体，微囊泡发生的机制目前也仍在研究中。

EVs内包含不同物质，包括主要组织相容性复合体2(major histocompatibility complex class II，MHC class II)[8]、糖基磷脂酰肌醇-锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins，GPI-anchored proteins)[9]、载脂蛋白E(apolipoprotein E，Apo E)[10]、mRNA及DNA片段[2]等参与调节生命活动的生物分子。尽管微囊泡和外泌体在细胞内不同的位置生成，但这两种不同EVs的合成过程有共同的细胞内机制和分选机制。EVs的生成过程是十分复杂的，往往取决于包含物和母体细胞的类型，同时也会受到细胞接收的其他刺激信号的影响。包含物通过逐步聚集，参与到EVs发芽、裂变和释放的过程。另外，EVs内含物的性质和含量具有特异性，经常受到母体细胞的生理或病理状态、调节其产生和释放的刺激以及促进其生成的分子机制的影响。

2.2 EVs的作用方式

由于EVs的大小和其表面分子特性的差别，不同EVs对受体细胞的识别和捕获能力也不尽相同。研究表明，外泌体的作用方式可以通过小胞饮作用的理论进行解释。而对于较大的微囊泡，其本身可通过与受体细胞的胞外特异性分子相互作用或膜与受体细胞膜融合而产生后续作用[11]。EVs在特定条件下与受体细胞相互作用后，释放其内容物，从而发挥对应的生物学功能。在受体细胞(可以是生产细胞本身)中，外源性的EVs会结合到细胞表面，并经历不同的作用过程。根据受体细胞类型的不同，它们可以保持与表面结合(例如与整合素结合)，并启动细胞内信号通路(例如抗原提呈过程)。同时，EVs还可以通过多种途径内化，包括网格蛋白依赖性和网格蛋白非依赖性途径介导的内吞作用，最终将内容物转移到受体细胞中[12-13]。外源性EVs可以通过典型的内体通路，由细胞外到达MVE。在MVE中，内化的囊泡可能与ILV混合。与含有溶酶体的MVE融合会导致EVs和其内容物的降解，此过程不断循环以促进受体细胞的新陈代谢[2,9]。除此之外，EVs还通过与细胞膜或MVE的有限膜的融合，释放其内容物进入细胞质或ILV中，参与细胞生命活动的调节。EVs与细胞表面的相互作用模式以及介导EVs内含物转移的具体机制尚未完全阐明，但这一过程对于如miRNA 等信号分子的传递效应十分重要。

2.3 疾病诊断与预后评估

在过去的十几年中，EVs被广泛认为是可靠的诊断和监测人类疾病状态的生物性指标[14]。EVs在机体不同的体液(血液、尿液、支气管肺泡液、胆汁和唾液等)中均能够存在。除了EVs的分布范围以外，其还可以通过携带来自母细胞的相关特定物质(如蛋白质、miRNAs、mRNAs、lncRNAs和脂质等)来动态地反映疾病状态[1-2]。研究证实，EVs的内容物反映着母细胞的病理生理特征，并且比其循环所处的生物流体更具有特异性[15]。同时，作为能够显示疾病特异性动态信息的EVs内容物，甚至具备评价疾病预后情况的重大潜力。在许多临床疾病中，如冠状动脉疾病、肾脏疾病、肝脏疾病、神经退行性疾病和自身免疫性疾病[15-19]等，EVs已被提出可作为预测疾病预后水平的可靠性指标。

2.4 组织工程与临床治疗

如前所述，机体中收集到的天然EVs，因携带有具体生物学意义的信息分子，使其有益于临床进行疾病诊断与预后评估。而因EVs具有能够穿越生物屏障和天然趋化性等特点，使得让EVs作为体内药物递送载体成为可能。近年来，随着组织工程技术的不断发展，EVs已经可以实现工程化的改造与构建，使其成为新的药物递送载体。相较于其他类似药物递送系统(如聚合物纳米颗粒和脂质体等)，EVs具有许多独特的优势[20]，它可以递送不同类型的物质，例如干扰RNA (siRNA)或药物活性分子等。EVs在血液中的稳定度较高，即使是体内远距离的传输，也可以特异性地完成递送[21-22]。此外，由于EVs的体积较小且具有生物源性，它可以绕过溶酶体的吞噬，将包含的内容物直接释放到受体细胞，从而发挥功能。由于EVs是来源于宿主自身的产物，所以不会引起机体强烈的免疫反应[20]。同时，EVs的亲水性核心也使其成为水溶性药物的优质载体[23]。目前使用EVs的治疗方法已经在体外和体内进行了检验，被证实可用于治疗不同的疾病，例如癌症、免疫或神经性疾病等等。目前，关于EVs的最新研究主要集中在如何通过有效地修饰，来改善EVs内容物的成分，提高递送靶向效率和精准调控分布位置。例如，研究者们想通过在EVs表面锚定一些特定设计的肽段，来实现精准识别靶细胞上的特定受体[1,24]，从而进一步加强EVs的治疗效果。

3 EVs的临床应用

随着人们对于EVs认知与研究的不断加深，其得到了越来越多的应用。EVs通过将其内容物传递给受体细胞，来参与受体细胞生命活动并调节机体稳态。EVs在免疫上是具有惰性的，因此能够最低程度的避免触发先天和适应性的免疫反应[25]。临床应用研究结果发现，树突状细胞分泌的EVs可以刺激免疫系统，用作抗肿瘤疫苗的研发。在肺癌和黑色素瘤患者治疗的临床试验中，采用EVs的免疫疗法也具有巨大潜力[26]。此外，MSCs来源的EVs已在动物模型中被证实可以用于治疗急性肾衰竭、皮肤损伤和心肌梗死等多种疾病。目前还有一些临床试验正在进行，主要是基于EVs的体外操作，装载特定的内含物(例如siRNA，miRNA和药物)，然后将其运送到目标细胞，从而发挥治疗效能[27-28]。因此，高精度、高特异性及免疫惰性的优点，使得EVs在临床疾病应用中具有巨大潜力。

3.1 心血管系统疾病

EVs通过调节细胞间信号，引导细胞外基质发生改变来应对血流动力学等环境的变化，从而帮助机体控制心血管的稳态。EVs从母细胞携带到细胞外的信息可以作用于局部(同一组织内)和远端(血流下游)的受体细胞。一方面，有研究表明EVs内包含的病理性生物信号分子可能进一步诱发或者加重各种心血管系统疾病。另一方面，研究表明将体外培养细胞(例如内皮细胞，心肌细胞等)获得的EVs注射到病变组织中可以促进组织功能的恢复。

由于EVs包含的不同生物分子可以反映出细胞表型的改变，临床上常将血液中的EVs作为一种非侵入性的检查来监测全身组织状态。这在心血管系统疾病的诊断中有很多应用。有研究表明，暴露于致动脉粥样硬化脂蛋白的平滑肌细胞，会释放miRNA谱显著改变的EVs，这其中包含的miRNA-24-3p和miRNA-130a-3p含量会相应减少[29]，而这两种miRNA在家族性高胆固醇血症患者的循环EVs中表达也降低。因此临床上可通过监测血液中EVs的miRNA-24-3p和-130a-3p含量变化筛选高胆固醇血症或动脉粥样硬化患者，从而增强诊断的可靠性与可信度。除了有助于临床诊断以外，EVs能够作为治疗载体帮助恢复组织稳态。例如有研究发现，通过引入体外细胞培养获得的EVs，可预防或逆转心血管系统的病理重塑。内皮细胞来源的EVs可包含功能性的内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)，eNOS可以通过自分泌的方式参与恢复脂肪酸诱导氧化应激[30]后的稳态。同时，也有研究表明，冠脉内注射心球样细胞来源的EVs可以减轻大鼠和猪急性心肌梗死中的心肌壁损伤[31]。以上提及的EVs修复作用可能是通过其在病变组织[32]中有效递送并提高稳态基因表达和非炎症表型的miRNA来实现的，这也为未来心血管疾病的治疗方法提供了新思路。

3.2 肝脏疾病

近期研究表明，EVs可用于检测、监测和预测肝脏疾病患者的疾病进展状况及生存率。以肝硬化为例，EVs计数可用于监测全身的炎症状态[33]，而EVs在肝硬化患者体内含量比正常的健康人更高[34]。同时，相较于健康的正常人，肝硬化患者血浆中含有CD4、CD8、CD11a、CD31、CD235和CK-18等表面标记的EVs亚群的数量有所增加[33]。前期有研究证实，CK-18标记的EVs水平与肝硬化病情的严重程度密切相关，并通过这一指标预测了疾病的6 个月死亡率[35]。此外，血浆来源EVs内包含的miRNA可作为评价患者纤维化水平的生物指标。通过检测机体血浆EVs内 miRNA-101、miRNA-122、miRNA-195、miRNA-224和let-7的变化，可以诊断肝硬化或监测其早期到晚期的进展情况，而检测体内EVs中miRNA-192的增加情况，有助于诊断非常早期的肝纤维化病变[34]。

除了疾病诊断与监测外，基于前体细胞和MSCs来源的EVs治疗肝脏相关疾病的应用研究也有很大前景。研究证实，对脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)进行 miRNA-122(一种肝星状细胞的抑制剂)转染[36]，而转染后ADMSCs产生的EVs可以抑制原代肝星状细胞和其LX2细胞系的活化与增殖，这可以直接抑制肝纤维化的发生与发展。同时，这些EVs也可以提高由CCl4注射诱导的肝纤维化小鼠的存活率。更加值得注意的是，同步在CCl4诱导的肝纤维化小鼠脾脏内注射ADMSCs来源的EVs(过表达miRNA-181-5p)，结果发现肝脏中I型胶原蛋白、Vimentin、α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和纤维连接蛋白的表达较对照组均明显减少[37]。同样，还有研究发现，在CCl4诱导小鼠肝纤维化的模型中，人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)来源的EVs减轻了肝纤维化的组织病理学改变，抑制了Caspase-3的活化，并降低了ROS与TGF-β的产生[38]。

3.3 肾脏疾病

EVs扮演着细胞间信使的角色，并通过不同类型的肾细胞，参与形成肾小球滤液的过程[1]。研究表明，足细胞来源的EVs附着在肾脏近端小管上皮细胞的刷状边缘，并易出现浓度依赖性内化[1,39]。在各种影响肾脏的病理因素刺激下，细胞出现应激反应，从而EVs的特性也发生改变[40]，提示疾病的发生和发展。比如，机械性牵张和高血糖环境会诱导肾小球滤液中EVs的释放，而这可以作为高血压和糖尿病肾病中肾小球损伤的早期尿液检测标志物。肾小球滤过液中释放的泌尿生殖道上皮脱落的EVs均可从尿液中提取，因此可作为考察泌尿系统的临床状况的非侵入性生物标志物[1]。同时，转录组学分析可以帮助确定尿液EVs的具体来源，比如EVs内包含特定的mRNAs，如编码podocin(膜蛋白，定位在肾小球)和 aquaporin 2(水通道蛋白2，定位在集合管)的mRNAs，可以表明其起源于肾元和集合管的特定区域。除此以外，全面的蛋白质组学或脂质组学分析研究也可以帮助识别尿EVs的来源，利于疾病诊断[1]。

除了标记不同类型的肾脏疾病外，目前临床试验证据也表明，EVs可以促进多种慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)的修复与再生。 EVs内的生物分子富含调节信息，能够参与调节受体细胞内包括炎症、氧化应激、细胞凋亡和血管生成等一系列的生理病理过程，而这些过程都与CKD 的疾病进展密切相关。高血压和糖尿病肾病患者的临床试验验证了EVs在改善肾损伤和功能障碍方面的安全性与有效性，并将能够释放EVs的MSCs定为CKD 患者细胞疗法的有利种子细胞。目前，在CKD 疾病模型中的研究揭示了 MSCs来源的 EVs 在保护肾脏结构和功能方面的可行性和有效性，推动了非细胞治疗在肾脏修复再生中的应用。

3.4 口腔系统疾病

唾液的EVs中已被证实包含有多种具有口腔疾病信息的生物活性分子，可以辅助完成口腔疾病的诊断。以口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)为例，研究表明OSCC患者的唾液微囊泡含量水平升高，这与患者临床表现和预后情况密切相关[41]。另有研究结果表明，OSCC患者唾液EVs中miR-412-3p 和 miR-512-3p的表达含量有所增加，而miR-302b-3p和 miR-517b-3p出现选择性富集[42]。这4 种唾液EVs中的 miRNAs均有辅助诊断 OSCC的潜在价值。除此以外，临床常见的牙周炎患者唾液EVs中的 PD-L1表达也被发现与非牙周炎患者间存在显著差异，可作为牙周炎的辅助诊断标记物[43]。不仅在诊断方面，EVs在口腔疾病的治疗中也有很大应用前景。研究证实，舌癌 Tca8113细胞能分泌包含肿瘤免疫相关蛋白的EVs，可以通过树突状细胞，诱导T细胞成为抗原特异性细胞毒性T细胞，从而进一步特异性杀伤肿瘤细胞[44]，为口腔肿瘤的免疫治疗提供了新可能。

3.5 免疫调节

EVs对先天性和适应性免疫的调节作用也不容忽视。一方面，在先天性免疫中，中性粒细胞趋化募集是由趋化中性粒细胞来源的EVs内包含的白三烯B4驱动自分泌/旁分泌级联反应所介导的[1]。最新研究表明，活化的单核细胞分泌的EVs内所包含的线粒体，可在内皮细胞中诱导系统性促炎I型IFN和TNF反应[45]，这可能是导致部分心血管疾病的潜在原因，通过分析血液中EVs内包含的相关物质，可以帮助提高疾病诊断与病情分析水平。与此同时，来自MSCs的EVs可以通过转移miR-451a、miR-1202、miR-630和miR-638等调控物质，作用于Toll样受体信号通路和NF-kB通路，参与抑制巨噬细胞介导的免疫应答反应[46]。因此，MSCs来源的EVs可以参与治疗多种炎症相关疾病，甚至可以作为免疫治疗药物载体发挥关键作用。另一方面，关于适应性免疫与EVs的关系，目前的研究发现MHC II类限制性抗原的呈递依赖于囊泡转运[47]。来自树突状细胞的EVs能够促进抗原特异性T细胞活化和T辅助细胞(Th)向Th1表型分化[1]。也有研究表明，T调节细胞通过EVs介导的miRNAs转移抑制Th1细胞增殖和细胞因子分泌，从而抑制Th1(CD4+ IFNgamma+)的炎症反应[1]。以上这些发现均表明，EVs可以作为免疫疾病治疗的新手段。

4 前景与展望

许多体外细胞与体内动物实验研究结果和部分临床研究数据表明，EVs在疾病的诊断和治疗中发挥着关键作用，但目前EVs的临床应用产品仍然较少，EVs在辅助临床诊断和疾病预后监测评估，参与疾病治疗的潜力仍然有待发掘。

EVs能够通过生物屏障，并且可以较为容易地从生物体液(如眼泪、血液、尿液等)中获得，EVs能提供机体器官或组织在病理生理条件下有价值的生物信息，尤其是对于某些无法获取或不方便直接获取的器官或系统，如中枢神经系统，肾脏和胚胎-胎儿胎盘组织等。这些宝贵信息有助于辅助疾病诊断与病情监测，甚至于疾病预后评估。但由于不同研究使用了不同的EVs分离和表征方法，因此在分析结果和总结结论方面也仍存在挑战。此外，抑制EVs的形成与释放可能是临床上新的治疗方法，对控制中枢神经系统炎症、转移性肿瘤扩散、肾性子痫等疾病有潜在的应用价值。EVs还可以作为纳米载体，将治疗药物转运到受体组织或细胞中，从而达到治疗目的。安全来源的EVs(例如MSCs来源EVs)可能包含选择性遗传物质或蛋白，靶向输送到受体组织或细胞，参与生命活动。因此，基于EVs的纳米载体技术为药物在人体内的定向传输提供了良好远景。然而，相关的大多数研究均是在体外和动物模型中进行的，这种方法在临床试验中的安全性和特异性仍然有待观察。总体来说，虽然EVs有很好的应用前景，但在其提取与鉴定标准化以及临床转化应用等方面还存在诸多挑战，因此在临床上广泛使用EVs仍需克服许多障碍，我们期待通过对EVs的不断深入研究，可以促进EVs在临床医疗成果转化方面的进一步发展。