柱前衍生HPLC测定草铵膦含量研究

姚先燕，杨 斌

（广安利尔化学有限公司，四川广安 638500）

草铵膦属磷酸类除草剂，施药后短时间内植物体内铵代谢陷于紊乱，细胞毒剂铵离子在植物体内积累，与此同时，光合作用被严重抑制，达到除草目 的[1]。草铵膦是目前广泛使用的有机磷类广谱触杀型除草剂，其具有内吸附作用不强、活性高、吸收好、低毒、环境兼容性好等特点，被称为强极性农药[2-3]。草铵膦又名草铵膦铵盐，化学名称为2-氨基-4｛羟基（甲基）膦酰基｝丁酸铵，其结构中含有磷酸盐、氨基、羟基、是极性强的两性化合物，分子结构不存在共轭双键，缺少发色和荧光基团特性，其分子量小，极性大易溶于水，不溶于有机溶剂。直接进行检测时存在仪器干扰大的问题，目前报道的关于草铵膦分析方法较多，有高效液相色谱方法[4-5]、柱前衍生液相色谱法[6-9]、柱后衍生液相色谱法[10]、液相色谱质谱连用法[11-13]及离子色谱法[14-16]等。本文采用氯甲酸-9-芴基甲酯（FMOC-Cl）作为衍生试剂，其介质与草铵膦的水溶性相匹配，反应过程简单，FMOC-Cl在碱性环境下，FMOC-基团取代目标化合物氮原子上的氢原子，生成了在检测仪器上具有强响应的衍生化合物FMOC-R（衍生化反应如图1所示），利用高效液相色谱对衍生后的草铵膦进行检测。从而能够检测微量以及痕量的草铵膦残留量，满足草铵膦样品含量检测要求。从而建立起一种快速、高效、准确、灵敏的测定草铵膦的分析方法。

图1 草铵膦和FMOC-Cl反应方程式

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1260 infinity ‖、超声波清洗器；试剂：乙腈、甲醇（均为色谱纯）、草铵膦标样、实验室一级水、85%磷酸（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、硼酸（分析纯）衍生试剂：2mg/mL FMOC-Cl（氯甲酸-9-芴基甲酯）乙腈溶液；硼酸溶液：0.4mol/L（24.72g硼酸+1 000mL水，溶解后用40%NaOH溶液调pH至8.5）；稀释剂：衍生试剂+水=1+1（V+V）

1.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil Plus 5μm C18，150×4.6mm； 波长：206nm；柱温：35℃；

流动相：乙腈+甲醇+1.8g/L磷酸水溶液=25+25+ 50（V+V+V）；流速：1.3mL/min；进样量：5μm；保留时间：草铵膦约5.0min；

1.3 操作步骤

标样溶液配制：准确称取0.05g（精确至0.0001g）草铵膦标样于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容，用移液管准确吸取5mL此溶液于50mL容量瓶，用稀释剂稀释并超声反应1min后，定容至刻度线。

试样溶液配制：准确称取约含草铵膦0.05g（精确至0.0001g）试样于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容，用移液管准确吸取5mL此溶液于50mL容量瓶，以后同标样溶液制备。

1.4 测定

在1.2色谱操作条件下，待色谱仪稳定后，先进数针标准溶液，直至相邻两针相对响应值变化不大于1.5%时，按标准溶液、样品溶液、样品溶液、标准溶液顺序进样。色谱图见图2

图2 草铵膦标样高效液相色谱图1.草铵膦主峰；2.剩余衍生试剂水解峰（FMOC-OH）；3.衍生试剂与氨根反应峰（FMOC-NH4）

1.5 计算

将测得的2针样品溶液以及前后2针标准溶液中草铵膦峰面积进行平均，试样中草铵膦含量X（%）按下式计算：

式中：A1为标样溶液中草铵膦峰面积的平均值；A2为试样溶液中草铵膦峰面积的平均值；M2为试样的质量，g；M1为标样的质量，g；P为标样中草铵膦的质量分数，%

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

检测波长的选择：通过二级管阵列检测器对草铵膦标样溶液进行光谱数据采集，得到了草铵膦从200~310nm的吸收光谱图，如图3所示，草铵膦206nm处有较好的吸收，故选择206nm为检测波长。

图3 草铵膦紫外吸收光谱视图

2.2 流动相的选择

根据化合物和Fmoc衍生试剂的特点，首先考察了乙腈、甲醇和纯水的比例，对草铵膦在C18柱上的保留时间及分离效果的影响。结果显示：在此条件下，草铵膦出峰时间太早且杂质峰无法分离；后续在流动相中添加一定量的磷酸，改变纯水的pH，随着流动相中纯水的pH逐渐降低，化合物与衍生试剂反应所产生的峰也逐渐分离，经过试验得出当纯水溶液的pH为2.0，乙腈、甲醇、磷酸水溶液的比例为25+25+50（V+V+V），流速为1.3mL/min时，有效成分与杂质能够得到很好的分离，并且也能有效地减少分析时间。

2.3 分析方法的线性相关性试验

准确称取草铵膦标样0.05g（精确至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用硼酸溶液溶解并定容至刻度线，吸取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL此溶液于50mL容量瓶，按1.3操作步骤进行衍生。在上述色谱条件下进行分析，以草铵膦浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，草铵膦线性方程式为y=47.895x+66.7，相关系数r为0.9999。如图4所示。

图4 草铵膦线性关系图

2.4 检测线和定量限

以3倍噪音为检测线，以10倍噪音为定量限。测得检测限为0.067μg/mL，定量限为0.205μg/mL

2.5 分析方法的精密度试验

分别对不同含量的三个样品按1.3操作步骤进行5次平行测定，测定结果为样品1标准偏差为0.03，变异系数为0.17%，样品2标准偏差为0.02，变异系数为0.09%，样品3标准偏差为0.02，变异系数为 0.02%.如表1所示。

表1 精密度测定结果

2.6 分析方法的准确度试验

在已知含量的三个样品中分别加入一定量的标准样品，在上述色谱条件下进行分析，测定得出样品1的平均回收率为99.93%，样品2的平均回收率为99.61%，样品3平均回收率为99.39%。如表2所示。

表2 分析方法的准确度试验结果

2.7 衍生溶液的稳定性试验

将处理好的衍生溶液在室温下放置不同时间，在1.2色谱条件下测定峰面积变化，如表3所示。

时间 0h 4h 8h 12h 24h峰面积 5 338.008 5 338.834 5 336.113 5 337.676 5 337.132

表3 放置时间对草铵膦衍生溶液的影响

从表3看出，草铵膦衍生溶液的峰面积变化波动＜1%，表明衍生物至少在24h内稳定

2.8 衍生时间的选择

衍生试剂与草铵膦反应的充分程度不仅影响色谱分析的重现性，而且影响衍生产物的检测限，为保证衍生反应完全，考察了不同衍生反应时间对峰面积的影响，如表4所示。

表4 衍生时间对草铵膦衍生产物的影响

从表4看出，草铵膦衍生产物的峰面积变化波动＜1%，据此认为在1min的反应时间内草铵膦已完成与衍生试剂的反应。因此，本方法最终选择的反应时间为1min。

3 结束语

本方法适用于各种草铵膦微量以及痕量的样品检测，具有较好的准确度和精密度，线性关系良好；能使有效成分与杂质能够得到很好的分离，并且也能有效地减少分析时间；衍生产物稳定，允许24h上机分析；衍生反应时间快，在1min内衍生试剂便能完全反应。