HPV23 L1蛋白的表达、纯化及活性鉴定

栗 宁， 陈玉梅， 周景明， 陈玉阁， 祁艳华， 殷佳佳， 李昱雅， 王爱萍

(郑州大学 生命科学学院 河南 郑州 450001)

0 引言

目前已经有300多种人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)被鉴定[1]。HPV可分为α属、β属等。其中，α属HPV也被称为黏膜HPV，主要感染生殖器和黏膜，导致良性皮肤疣和其他疾病；β属HPV主要侵染部位是皮肤[2]。HPV23是最常见的β属HPV，其基因组是由7.3 kb的环状双链DNA组成[3]。HPV主要衣壳蛋白L1是可自组装的病毒样颗粒(VLPs)[4]，具有类似天然病毒的血凝活性，是预防性疫苗研究的主要靶点[5]。研究发现，HPV23与皮肤鳞状细胞癌、非黑色素瘤皮肤癌、眼汗管瘤、乳腺癌、基底细胞癌、疣状表皮发育不良、非生殖性脂溢性角化病等有关[6]。

高校智慧校园是校园信息化建设的必然趋势。充分了解智慧校园的支撑技术并把握智慧校园的建设目标，有利于高校智慧校园的有效建设。本文论述了高校智慧校园的支撑技术，解析了高校智慧校园的建设目标，以期给我国高校智慧校园建设提供参考，从而能真正在把握技术和建设目标的基础上，做出科学的建设方案和实施对策，构建真正充满智慧的智慧校园，从而提高高校的工作效率、管理效率和决策效率，提高信息利用率和核心竞争力，满足高校教学、科研和管理工作的需要。■

目前，关于HPV23亚型L1蛋白的研究还比较少。本文尝试构建带有不同融合标签的原核表达载体，分析重组蛋白HPV23 L1的表达情况及活性，旨在筛选HPV23 L1蛋白高表达菌株，为HPV23亚型L1蛋白的结构和功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种与载体

pUC57-HPV23 L1由上海生工生物工程有限公司合成；大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21来自TaKaRa公司；原核表达载体pET28a、pET30a、pET32a和pESUMO均由郑州大学生命科学学院分子免疫实验室保存。

1.2 重组表达载体的构建

1.2.1目的基因及引物的设计与合成 根据NCBI网站公布的 HPV23 L1蛋白序列(GenBank.ARA 71354.1)及大肠杆菌的密码子偏好性，利用生物信息学软件优化并送至上海生工生物工程有限公司合成HPV23 L1基因。分别在其5’末端与3’末端加入EcoR I、BasI、XhoI限制性酶切位点，设计合成相应的引物，引物列表如表1所示。

表1 引物列表Table 1 Primers list

二是做好大宗中药材开发工作，打造品牌，扩大规模。重点发展用量大、销路广的板蓝根、黄芪、甘草等常用大宗中药材，兼顾发展一些有销路的红花、柴胡等中药材。

图1 重组表达载体构建策略Figure 1 The construction strategy of recombinant expression vector

1.3 重组表达载体的初步表达与鉴定

SDS-PAGE鉴定重组蛋白L1的表达情况如图3所示。经生物信息学预测发现，重组HPV23 L1蛋白的相对分子质量约为57 400，具有较多亲水性区域(图3A)。将4种重组表达菌pET28a-23L1-BL21、pET30a-23L1-BL21、pET32a-23L1-BL21和pESUMO-23L1-BL21进行诱导表达，经12% SDS-PAGE鉴定，结果显示，pET28a-23L1(HIS-23L1融合蛋白)和pET30a-23L1(HIS-S-23L1融合蛋白)几乎无目的蛋白表达，而pESUMO-23L1(SUMO-23L1)和pET32a-23L1(TRX-23L1)表达产物在大约80 kD处有目的条带(图3B)。

1.4 重组蛋白的可溶性分析

在pH 8.0的含有250 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液条件下，用Ni-NTA亲和层析法纯化重组SUMO-23L1蛋白，经12% SDS-PAGE鉴定，重组蛋白的纯化结果如图5所示。结果表明，纯化后目的蛋白的纯度约为90%。

1.5 重组蛋白的纯化及鉴定

利用SWISS-MODEL软件对HPV23 L1蛋白进行同源建模，HPV23 L1蛋白同源建模及重组蛋白血凝活性鉴定结果如图6所示。可以看出，HPV23 L1蛋白单体结构(图6A)和五聚体结构(图6B)与参考序列牛乳突瘤病毒(bovine papillomavirus type 1，BPV1)的L1蛋白(PDB：3iyj)结构相似(图6C)，二者序列同源性为49.39%。血凝实验结果显示，重组SUMO-23L1蛋白有凝集小鼠红细胞的能力(图6D)，说明本研究制备的重组HPV23 L1蛋白具有较高的活性。

1.6 重组蛋白的活性分析与鉴定

1.6.1同源建模 利用SWISS-MODEL软件对HPV23 L1蛋白进行同源建模，预测HPV23 L1蛋白三维结构。

1.6.2血凝实验 取96孔微型血凝反应板，第1孔到第8孔均用25 μL PBS铺底。吸取25 μL纯化的HPV23 L1重组蛋白加入第1孔，充分混匀后进行2倍倍比稀释，一直倍比稀释至第5孔，在第6、7、8孔中分别加入25 μL PBS设置为阴性对照。将25 μL 1%小鼠红细胞悬液从第8孔倒加至第1孔，震荡混匀，室温静置40 min，拍照并记录实验结果。

1.2.2重组蛋白的生物信息学分析及表达策略 用DNASTAR软件对HPV23 L1蛋白二级结构及其亲水性和疏水性进行分析，选择pET28a(Kan+)、pET30a(Kan+)、pET32a(Amp+)和pESUMO(Amp+)用于构建原核表达载体。pET28a、pET30a和pET32a分别用EcoR I/XhoI进行双酶切，pESUMO用BasI/XhoI进行双酶切，回收双酶切产物，与含对应酶切位点的引物进行目的基因PCR扩增，再进行双酶切回收后的产物连接，构建HPV23 L1蛋白重组表达载体，分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，从经菌液PCR鉴定的阳性菌株中提取质粒，通过双酶切鉴定及测序，最终获得HPV23 L1蛋白的4种带有不同融合标签的重组表达载体。重组表达载体构建策略如图1所示。

2 实验结果分析

2.1 重组表达载体的构建

综上所述，本文对长河坝水电站泄洪系统高陡自然边坡治理的工程实例进行自然边坡危险源的分析、评价和等级划分，并制定相对应的治理方案。从总体上确定了自然边坡治理工艺和流程，在生态环保、安全、工期及成本等方面具有明显的优势，取得了良好的工程效果，具有良好的生态环保和社会经济效益，也为类似工程提供了充足的施工经验和技术。

A为pET28a-23L1、pET30a-23L1的菌液PCR鉴定(M：Marker；1～5：pET28a-23L1扩增产物；6～10：pET30-23L1扩增产物)；B为pET32a-23L1的菌液PCR鉴定(M：Marker；11～13：pET32a-23L1扩增产物)；C为pESUMO-23L1的菌液PCR鉴定(M：Marker；1～5：pESUMO-23L1扩增产物)；D为重组表达载体的双酶切鉴定(M：Marker；1：pET30a-23L1;2：pET30a空载;3：pET32a-23L1;4：pET28a-23L1;5：pESUMO-23L1)。图2 重组表达载体的菌液PCR及双酶切鉴定Figure 2 The identification of recombinant expression vector by PCR and double enzyme digestion

2.2 原核表达载体的诱导表达及初步鉴定

将pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1这4种重组表达载体阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆，经菌液PCR获得4种重组表达菌pET28a-23L1-BL21、pET30a-23L1-BL21、pET32a-23L1-BL21和pESUMO-23L1-BL21。将4种重组表达菌按1∶1 000接种在加有Amp+或Kan+抗性的5 mL LB液体培养基中，37 ℃摇床上220 r/min过夜培养，以活化菌种；过夜活化的菌种再按1∶100接种于相应抗性的5 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min培养至OD600约为0.6。加入0.3 mmol/L的诱导剂IPTG，16 ℃、220 r/min诱导18 h。经12% SDS-PAGE鉴定，分析重组蛋白的表达情况。

重组表达载体的菌液PCR及双酶切鉴定结果如图2所示。重组表达载体构建成功后，经菌液PCR鉴定发现，扩增产物条带出现在大约1 521 bp(图2 A、2B、2C)；EcoR I/XhoI或BasI/XhoI双酶切鉴定显示重组表达载体构建成功(图2D)。将阳性质粒测序结果与合成的HPV23 L1序列进行比对分析，结果显示，两序列完全一致，说明pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1这4种重组表达载体构建成功。

2.3 重组蛋白HPV23 L1的可溶性分析

诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L，16 ℃诱导表达18 h后收集pESUMO-23L1及pET32a-23L1的表达菌体，PBS重悬后经超声破碎处理，上清液和沉淀分别用12% SDS-PAGE进行鉴定。HPV23 L1重组蛋白的可溶性分析及Western blot鉴定结果如图4所示。结果显示，pESUMO-23L1和pET32a-23L1的超声上清液和沉淀在大约80 kD的位置均存在蛋白条带(SUMO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白)，而重组SUMO-23L1蛋白表达量整体高于TRX-23L1蛋白(图4A、4B)；重组SUMO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白均可与HIS单抗发生反应(图4C、4D)。

2.4 重组蛋白HPV23 L1的纯化

诱导剂IPTG的浓度为0.3 mmol/L，16 ℃、220 r/min诱导表达18 h后收集表达菌体，4 ℃、12 000 r/min离心2 min，收集菌体，用5 mL pH 7.4的PBS重悬菌体。经超声破碎后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，得到超声上清液和超声沉淀，通过12% SDS-PAGE分析重组目的蛋白的可溶性。

2.5 重组蛋白HPV23 L1的活性鉴定

根据1.4小节的结果，选择高表达菌株进行后续实验。诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L，16 ℃诱导表达18 h后收集菌体，用 pH 8.0 的含有250 mmol/L NaCl 的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液重悬菌体后超声破碎，取上清液，选择Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白。用咪唑浓度梯度法(Wash Buffer，pH 8.0的含有250 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液+20 mmol/L咪唑；Elution Buffer，pH 8.0 的含有250 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液+200 mmol/L咪唑)进行洗脱，纯化后收集各组分，用12% SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。

A～B为SDS-PAGE(M：Marker；1：pET32a-23L1超声上清液；2：pET32a-23L1超声沉淀；3：pESUMO-23L1超声上清液；4：pESUMO-23L1超声沉淀)；C～D为Western blot(5：pET32a-23L1超声上清液；6：pESUMO-23L1超声上清液)。图4 HPV23 L1重组蛋白的可溶性分析及Western blot鉴定Figure 4 Solubility analysis and Western blot identification of HPV23 L1 recombinant protein

M：Marker；1～2：纯化的SUMO-23L1蛋白。图5 SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯化结果Figure 5 The purification results of recombinant protein identified by SDS-PAGE

A为HPV23 L1蛋白单体结构；B为HPV23 L1蛋白五聚体结构；C为BPV1 L1蛋白结构(PDB：3iyj)；D为重组蛋白血凝活性鉴定(1和2为重复实验，其中1∶2～1∶32为纯化的SUMO-23L1蛋白2倍倍比稀释的结果；PBS为阴性对照)。图6 HPV23 L1重组蛋白同源建模及血凝活性鉴定Figure 6 The homologous modeling and hemagglutination activity of HPV23 L1 recombinant protein

3 讨论

目前商品化的HPV疫苗主要基于用杆状病毒表达的HPV16、HPV18等α属高危型HPV 的L1蛋白[7-8]。有许多研究者利用GST融合标签或者GST融合标签与伴侣蛋白共表达,成功实现α属高危型HPV L1蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达[9-10]；也有研究者利用SUMO融合标签在原核表达系统中制备HPV16、HPV18等α属高危亚型HPV 的L1蛋白[11-12]。

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本研究主要通过构建4种原核重组表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1，分析不同融合标签对重组蛋白表达情况的影响。经SDS-PAGE分析发现，重组表达后，pET32a-23L1和pESUMO-23L1在大约80 kD处有一条明显的条带，比预测理论值(70 kD)偏大，推测可能是由于标签中6个连续的带正电荷的碱性氨基酸造成HIS-tag融合蛋白在SDS-PAGE中迁移速率变慢[12]。随后的Western blot鉴定结果也证实了80 kD处为重组目的蛋白。pET32a-23L1和pESUMO-23L1均有可溶性表达，且pESUMO-23L1的可溶性表达量较高，这与本课题组前期研究结果[12]一致。

经营模式。在具体经营上主要以专业合作社、种养大户、家庭农场为主体，通过进行土地租赁或其他流转方式，实施集约化、规模化、标准化生产经营。

此外，用HIS单抗进行Western blot检测时发现，pET32a-23L1和pESUMO-23L1均在约45 kD处有一条明显的条带，推测可能是由于重组蛋白分子部分降解引起的。通过SWISS-MODEL软件同源建模发现，HPV23 L1蛋白与BPV1 L1蛋白的序列同源性为49.39%，并且HPV23 L1蛋白与参考序列BPV1 L1蛋白(PDB：3iyj)的结构极其相似，也可以形成五聚体结构。经血凝实验证实，该重组蛋白具有凝集小鼠红细胞的能力，说明所获得的HPV23 L1蛋白具有较高的活性，为进一步研究HPV23 L1蛋白的结构和功能奠定基础。