广西地区早产儿氨基酸代谢特点研究

林彩娟 耿国兴 彭振仁 黄小桃 吴柳霖徐钰琪 李威 钱家乐 罗静思

（1.广西壮族自治区妇幼保健院遗传代谢中心实验室，广西南宁 530012；2.广西出生缺陷预防控制研究所，广西南宁 530012；3.广西生殖健康与出生缺陷防治重点实验室，广西南宁 530012；4.广西新生儿疾病筛查中心，广西南宁 530012）

遗传代谢病（inherited metabolic diseases，IMD）是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积，或终末代谢产物缺乏，引起一系列临床症状的一组疾病［1］。早产是IMD发生的重要影响因素［2］。与足月儿相比，早产儿是新生儿中的特殊群体，其脏器生理功能的发育尚不完善，部分氨基酸代谢相关酶活性不足，致使部分氨基酸的代谢受阻［3］。串联质谱技术是一项可同时完成多种氨基酸及肉碱代谢物检测的高效技术［4］。目前已有相关研究报道出生体重、胎龄等因素均会对新生儿IMD筛查指标产生影响［5-6］，因此临床上依据足月儿参考标准对早产儿筛查指标进行判读会降低结果的准确率，但国内尚无大数据的临床研究来建立早产儿体内氨基酸水平的参考范围，且氨基酸的代谢水平在一定程度上反映了早产儿体内的营养代谢状态。为此，本研究基于串联质谱技术，通过回顾性调查分析广西地区早产儿的血氨基酸水平，比较早产儿与足月儿的血氨基酸谱差异，为实验室建立早产儿血氨基酸水平参考标准和临床判读提供科学依据，同时从代谢的角度为早产儿营养提出指导意见。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2018～2020年于广西新生儿疾病筛查中心进行IMD筛查且筛查结果为阴性（未患IMD）的30 757例新生儿的临床资料，其中早产儿2 146例、足月儿28 611例。根据胎龄分为极早产组（胎龄＜32周，n=209）、中期早产组（32周≤胎龄＜34周，n=307）、晚期早产组（34周≤胎龄＜37周，n=1 630）；根据出生体重分为极低出生体重组（出生体重＜1 500 g，n=161）、低出生体重组（1 500 g≤出生体重＜2 500 g，n=1 085）组、正常出生体重组（2 500 g≤出生体重≤4 000 g，n=900）；根据出生后采血时间分为采血时日龄3～7 d组（n=1 664）、8～14 d组（n=314）、15～28 d组（n=168）。将37周≤胎龄≤42周、2 500 g≤出生体重≤4 000 g、出生后3～7 d采血的足月健康新生儿纳入正常对照组。本研究获得广西壮族自治区妇幼保健院伦理委员会的批准（桂妇保院医研伦快审［2020-1］59号），且所有新生儿监护人均签署知情同意。

1.2 标本采集与实验室检测

采集出生后3～7 d充分哺乳的正常新生儿及出生3 d后早产新生儿足跟血样本，滴于S&S903专用采血滤纸片上，自然渗透、无污染、自然晾干后递送至广西新生儿疾病筛查中心，采用串联质谱法检测氨基酸水平。

1.3 检测指标

检测指标包括11种氨基酸，分别为瓜氨酸（citrulline，Cit）、苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、蛋 氨 酸（methionine，Met）、酪 氨 酸（tyrosine，Tyr）、丙氨酸（alanine，Ala）、缬氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、精氨酸（arginine，Arg）、鸟氨酸（ornithine，Orn）、甘氨酸（glycine，Gly）、脯氨酸（proline，Pro）。

1.4 统计学分析

采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学分析，正态分布的计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用协方差分析，控制相关的影响因素，估算不同分组间各指标的调整测量值的分布范围差异，组间两两比较采用LSD-t检验。非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同胎龄早产儿基本资料

本研究将2 146例早产儿按胎龄分组，补充其采血前的生理病理信息，包括性别、胎龄、出生体重、采血日龄、新生儿黄疸、新生儿肺炎、静脉营养使用情况及母亲孕期的疾病信息。结果显示胎龄、出生体重、采血日龄、新生儿肺炎、静脉营养在早产儿各组间的分布比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同胎龄早产儿基本资料及母亲孕期疾病情况分布比较

2.2 各影响因素与氨基酸指标的相关性分析

将早产儿各影响因素与氨基酸指标进行相关性分析发现，Met、Ala、Val、Leu、Gly、Pro与性别呈正相关；Cit、Ala与胎龄呈正相关，Phe、Met、Val、Arg与胎龄呈负相关；Tyr、Ala、Val、Leu、Pro与出生体重呈正相关；Cit、Met、Ala、Arg与采血日龄呈正相关，Phe、Val与采血日龄呈负相关；Cit、Ala、Val、Leu、Orn、Gly、Pro与采血前黄疸呈负相关；Tyr、Ala、Orn、Gly、Pro与采血前肺炎呈负相关；除Tyr与静脉营养呈负相关外，Cit、Phe、Met、Val、Leu、Arg、Orn、Pro均与静脉营养呈正相关；Phe、Ala、Val、Leu、Orn、Gly、Pro与母亲妊娠糖尿病呈负相关（均P＜0.05）。见表2。

表2 11种氨基酸指标检测结果与影响因素的相关关系矩阵

2.3 不同胎龄早产儿组氨基酸代谢水平特点

采用协方差分析控制与11种氨基酸代谢水平相关的影响因素，调整不同胎龄早产儿组间氨基酸指标的测量水平，并与正常对照组进行比较，结果显示11种氨基酸在各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其中Phe、Arg在极早产、中期早产、晚期早产组中水平高于正常对照组（P＜0.05），Ala、Val、Orn、Gly、Pro在极早产、中期早产、晚期早产组中水平均低于正常对照组（P＜0.05）；且从极早产到足月发现Arg随胎龄增加而递减，Ala随胎龄增加而递增；Cit、Met在极早产、中期早产组中水平高于正常对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 不同胎龄组早产儿和正常对照组足月儿全血氨基酸代谢水平比较 （±s，μmol/L）

表3 不同胎龄组早产儿和正常对照组足月儿全血氨基酸代谢水平比较 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］缬氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鸟氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示与正常对照组比较，P＜0.05。

P值氨基酸正常对照组(n=28 611)极早产组(n=209)中期早产组(n=307)晚期早产组(n=1 630)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.079±0.024 60.915±0.083 22.445±0.037 103.081±0.238 311.756±0.526 147.454±0.214 175.574±0.253 7.857±0.046 149.073±0.373 531.544±0.997 198.701±0.289 14.160±0.280a 63.687±0.967a 27.765±0.428a 82.572±2.784a 207.497±6.160a 137.991±2.507a 178.395±2.956 20.851±0.538a 135.207±4.365a 423.046±11.664a 165.634±3.376a 14.348±0.231a 66.837±0.798a 26.828±0.353a 102.311±2.297 224.066±5.083a 142.652±2.068a 187.588±2.439a 16.944±0.444a 127.162±3.602a 417.756±9.624a 165.193±2.786a 13.114±0.100 63.512±0.346a 26.670±0.153 115.199±0.997a 260.126±2.206a 133.893±0.898a 170.563±1.059a 8.590±0.193a 122.617±1.563a 507.656±4.177a 177.179±1.209a 14.818 37.407 101.196 65.845 353.218 225.253 42.310 373.610 387.395 293.323 545.221

2.4 不同出生体重早产儿组氨基酸代谢水平特点

采用协方差分析控制与11种氨基酸代谢水平相关的影响因素，比较早产儿不同出生体重组间与正常对照组氨基酸水平的差异，结果显示11种氨基酸在各组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05），其中Ala、Val、Pro水平随出生体重增加而增加，但仍较正常对照组低。比较极低出生体重组与正常对照组，除Phe、Leu外其他氨基酸水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；低出生体重组与正常对照组比较，除Leu外其他氨基酸水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；正常出生体重组与正常对照组比较，发现Cit、Arg、Gly水平差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 不同出生体重组早产儿和正常对照组足月儿全血氨基酸代谢水平比较 （±s，μmol/L）

表4 不同出生体重组早产儿和正常对照组足月儿全血氨基酸代谢水平比较 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］缬氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鸟氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示与正常对照组比较，P＜0.05。

P值氨基酸正常对照组(n=28 611)极低出生体重组(n=161)低出生体重组(n=1 085)正常出生体重组(n=900)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.035＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.079±0.024 60.915±0.083 22.445±0.037 103.081±0.238 311.756±0.526 147.454±0.214 175.574±0.253 7.857±0.046 149.073±0.373 531.544±0.997 198.701±0.289 14.425±0.319a 62.658±1.102 27.982±0.488a 74.651±3.168a 203.915±7.019a 134.066±2.857a 177.605±3.370 20.096±0.616a 130.331±4.974a 425.968±13.291a 162.190±3.845a 13.602±0.123a 64.247±0.425a 24.571±0.188a 106.341±1.220a 241.306±2.704a 134.683±1.101a 175.115±1.298 12.024±0.237a 122.650±1.916a 461.694±5.120a 169.310±1.481a 12.955±0.135 63.954±0.466a 22.030±0.207a 121.157±1.340a 268.349±2.969a 134.850±1.208a 171.441±1.426a 8.089±0.260 125.673±2.104a 527.364±5.622 182.578±1.626a 11.977 33.093 84.546 88.331 352.165 72.496 2.875 226.986 101.791 79.703 181.610

2.5 出生后不同采血日龄组早产儿氨基酸代谢水平特点

采用协方差分析控制与11种氨基酸代谢水平相关的影响因素，比较早产儿出生后采血不同日龄组间氨基酸水平差异，结果显示除Orn外其他氨基酸代谢水平差异均有统计学意义（P＜0.05），其中Cit、Met、Arg水平随日龄增加逐渐升高（P＜0.05），而Phe、Tyr、Ala、Pro水平随日龄增加而降低（P＜0.05）。不同日龄组间两两比较，发现8～14 d组与3～7 d组比较除Val、Orn外差异均有统计学意义，15～28 d组与3～7 d组比较除Leu、Orn外均有统计学差异，8～14 d组与15～28 d组比较除Orn、Gly外 差 异 均 有 统 计 学 意 义（P＜0.05）。见表5。

表5 不同采血日龄组早产儿全血氨基酸代谢水平 （±s，μmol/L）

表5 不同采血日龄组早产儿全血氨基酸代谢水平 （±s，μmol/L）

注：［Cit］瓜氨酸；［Phe］苯丙氨酸；［Met］蛋氨酸；［Tyr］酪氨酸；［Ala］丙氨酸；［Val］缬氨酸；［Leu］亮氨酸；［Arg］精氨酸；［Orn］鸟氨酸；［Gly］甘氨酸；［Pro］脯氨酸。a示与3～7 d组比较，P＜0.05；b示与8～14 d组比较，P＜0.05。

P值氨基酸3～7 d组(n=1 664)8～14 d组(n=314)15～28 d组(n=168)F值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.126＜0.001＜0.001 Cit Phe Met Tyr Ala Val Leu Arg Orn Gly Pro 13.030±0.088 65.114±0.377 23.155±0.184 115.249±1.188 253.924±1.860 136.068±0.925 170.619±1.231 9.816±0.275 123.584±1.288 513.023±3.712 176.817±1.084 14.152±0.202a 61.613±0.869a 25.256±0424a 99.564±2.734a 241.216±4.281a 138.290±2.128 189.782±2.833a 13.714±0.633a 125.204±2.966 398.039±8.546a 170.289±2.495a 15.562±0.276a,b 57.485±1.187a,b 27.370±0.579a,b 79.779±3.737a,b 225.529±5.852a,b 125.057±2.910a,b 174.939±3.873b 17.394±0.865a,b 132.180±4.055 389.837±11.684a 157.384±3.410a,b 46.374 23.188 31.788 49.734 13.070 7.550 19.293 45.791 2.075 113.320 16.290

3 讨论

氨基酸是胎儿及新生儿主要的营养物质，氨基酸紊乱容易导致胎儿死亡及宫内生长受限等问题［7］。氨基酸缺乏会引起人体生长迟缓、生理机能减退和对疾病抵抗力降低；相反，如果体内某些氨基酸的浓度太高，又会导致一些疾病的发生，这类疾病统称为氨基酸代谢病［8］。氨基酸在蛋白质合成、免疫应答、神经内分泌调节及器官功能成熟等生命活动的各个方面具有重要作用，与早产儿的生长发育和疾病发生密切相关［9］。开展早产儿氨基酸代谢研究十分必要。本研究利用串联质谱技术对早产儿氨基酸代谢产物进行检测，分析在不同胎龄、出生体重和采血日龄条件下其代谢特点。

早产儿胎龄对氨基酸指标影响较大。由于早产儿体内相关代谢指标成熟度的差异，血液代谢物水平也有较大差异，检测结果偏高或偏低。以胎龄分组控制了相关混杂因素后研究发现，11种氨基酸中早产儿各胎龄组与正常对照组比较均有差异，早产儿体内存在多种氨基酸代谢异常，其中Phe、Arg在极早产、中期早产、晚期早产组中水平高于正常对照组，而Ala、Val、Orn、Gly、Pro水平则降低，与周婧瑶等［8］、刘丹阳等［10］相关研究报道基本一致，且从极早产到足月发现Arg随胎龄增加而递减，Ala随胎龄增加而递增。Arg水平偏高可能与早产儿体内有应激性调节有关［11］，而低胎龄可能引起Phe羟化酶活性轻度延迟，从而造成一过性的Phe升高［12］，Ala、Val、Orn、Gly、Pro水平低于正常对照组，可能是早产儿的胎盘氨基酸转运功能受损或氨基酸合成能力不足及低效率的营养吸收导致［13-14］。考虑到晚期早产与足月胎龄的接近性，我们还对比了晚期早产儿与足月儿氨基酸水平，结果发现除Cit、Met外其余9种氨基酸水平均有差异，因此可推测出早产儿在过渡到足月儿相同的营养阶段时，Cit和Met已接近足月儿水平。此外，在极早产、中期早产和晚期早产组中Met、Arg、Orn水平随着胎龄增加而降低，而Tyr、Ala水平随着胎龄增加而升高，Phe、Val、Leu随胎龄增加呈先升高后降低的趋势，Gly、Pro随胎龄增加先降低后升高的趋势。由此证明早产儿体内氨基酸水平在不同胎龄期存在着发育不平衡状态。

不同出生体重早产儿氨基酸代谢水平不同。本研究控制了相关影响因素后早产儿不同出生体重组与正常对照组比较，11种氨基酸均有差异，其中Ala、Val、Pro水平随出生体重增加而增加，但仍较正常对照组低，部分指标与陈玉霞等［15］文献报道的相比于足月儿，非足月儿的Val、Pro水平明显降低一致。正常出生体重组与正常对照组比较，发现Cit、Arg、Gly水平差异无统计学意义，氨基酸基本达到足月儿水平，由此推测不同胎龄早产儿出生体重越大越接近正常时Cit、Arg、Gly水平。此外，在不同出生体重早产儿分组中，发现Cit、Met、Arg水平随着出生体重增加而降低，而Tyr、Val、Ala、Gly、Pro水平随着出生体重增加而升高。

不同采血日龄组早产儿氨基酸代谢水平不同。本研究比较早产儿出生后不同采血日龄组间差异，除Orn外其余氨基酸水平差异均有统计学意义，其中Cit、Met、Arg水平随日龄增加逐渐升高，而Phe、Tyr、Ala、Pro水平随日龄增加而降低，说明随着日龄增加早产儿食量逐渐增加，Cit、Met、Arg等部分氨基酸的摄入和吸收增加，Ala对肝脏有很强的修复功能使得肝脏发育逐渐成熟，肝脏中酶代谢活性增强导致Phe降低，Tyr、Pro促进了早产儿的消化、吸收和代谢功能逐渐成熟。该结论除Met、Pro不同外，其余与董丽萍等［11］研究基本相符，考虑与早产儿营养期间可能充分摄入或吸收了Met，而Pro摄入或吸收不足有关。不同日龄组两两比较发现，8～14 d组与3～7 d组比较除Val、Orn外均有差异，15～28 d组与3～7 d组比较除Leu、Orn外均有差异，8～14 d组与15～28 d组比较除Orn、Gly外均有差异，可见营养阶段的过渡与日龄增长密不可分，在早产儿机体发育不平衡且营养不足情况下，根据具体情况推迟超过7 d采血，同时以日龄结合营养阶段分析氨基酸谱的变化更有利于临床实践中的营养干预。

串联质谱技术通过检测早产儿干血斑中的氨基酸含量变化而判断是否可能患有某种或多种IMD。早产儿（胎龄＜37周）、低体重儿（出生体重＜2 500 g），由于其自身、出生前后环境及护理治疗的复杂性，对IMD筛查结果可产生影响，导致漏筛及筛查结果假阳性率或假阴性率升高［16］。氨基酸在早产儿体内的代谢异常复杂，本研究发现不同胎龄、出生体重及采血日龄均会影响早产儿氨基酸代谢，不同条件下氨基酸在早产儿体内的分布不同，综合以上因素提示早产儿Arg水平随着胎龄、出生体重增加而降低，随日龄增加而升高，而Tyr、Ala水平随着胎龄、出生体重增加而升高，随日龄增加而降低，因此了解早产儿氨基酸代谢变化特点为实验室选取适合的阳性截断值并结合胎龄、出生体重及采血日龄进行判读和为临床正确诊断提供科学基础，也为改善早产儿营养代谢状况提供了科学依据。本研究中发现相对于足月儿，低胎龄低体重早产儿Ala、Val、Gly、Pro水平较低，提示临床优化方案进行营养支持，此外当早产儿血中个别氨基酸水平明显改变时需引起临床医师注意，在静脉营养管理中更应注意各种氨基酸摄入的平衡。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。