海豚链球菌灭活疫苗对杂交鲟免疫效果的研究

文/王静波 王小亮 曹欢 戴旭平.2 王澎 徐立蒲.2*

海豚链球菌是鱼类主要病原菌之一，给鱼类健康养殖带来极大风险。为探索海豚链球菌灭活疫苗对鲟鱼免疫效果，本文利用前期从杂交鲟鱼分离得到海豚链球菌菌株LY160816K制备了灭活疫苗，并通过腹腔注射和浸泡两种方式免疫杂交鲟，免疫第28d后用半数致死量浓度（LD）攻毒以评价海豚链球菌灭活疫苗对杂交鲟的免疫保护效果。结果显示，本研究所制备的海豚链球菌灭活疫苗对杂交鲟具有较好的免疫效果，有较好的推广应用潜力。

鲟鱼是一种经济价值很高的大型鱼类，目前我国大部分地区均有养殖，年产量高达8万余t，占世界鲟鱼养殖总量的80%以上。由于高密度养殖等诸多因素，导致鲟鱼病害频发，患病后死亡率不断升高，影响了鲟鱼养殖业健康发展。近年来，有关鲟鱼感染海豚链球菌（）的报道较多，由此病原菌引发的鲟鱼疾病发病率可达20%～30%，死亡率高达70%以上。然而，我国目前尚无有效防治鱼类海豚链球菌病的药物，海豚链球菌对鲟鱼产业发展的影响愈加明显，打击了养殖户的积极性。20世纪90年代，国外就已开展了鱼类海豚链球菌疫苗的研制工作，并在实际生产中取得了较好的效果。近年我国也陆续开展了罗非鱼和牙鲆海豚链球菌疫苗研究，但尚未有针对鲟鱼海豚链球菌疫苗研究的报道。为探索通过疫苗免疫提高鲟鱼抗病力的方法，本文将从杂交鲟分离纯化得到的海豚链球菌制备为灭活疫苗，采用注射和浸泡两种方式免疫健康杂交鲟，探索免疫应答反应和保护效果，以期为鲟鱼海豚链球菌病的防控技术研究提供支撑。

一、材料与方法

（一）试剂

主要有脑心浸液培养基（BHIB）、脑心浸液琼脂培养基（BHIA）、哥伦比亚血琼脂培养基（BA）、API 20S TREP鉴定试剂条、UNIQ-10柱式细菌基因组抽提试剂盒和37%～40%甲醛溶液等。

（二）菌株复壮致病

将冻存的海豚链球菌菌株LY160816K（分离于河北保定某鲟鱼养殖场的患病杂交鲟）复苏、纯化，然后通过腹腔注射于健康杂交鲟复壮后再次分离、纯化、PCR分析后备用。

（三）LD50测定

将复壮后的菌株经肉汤培养基扩大培养，离心收集菌体制备含菌量3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL和3.5×10cfu/mL的菌悬液，分别腹腔注射杂交鲟（0.2mL/尾），每组设置2个平行（10尾/组）。注射后观察试验鱼的发病情况，统计死亡率，采用改良寇氏法计算菌株的LD：

LD=lg-1[X-i（∑p-0.5）]

其中，X为最高浓度组剂量对数，i为相邻两组剂量对数差，∑P为各试验组死亡率之和。

（四）疫苗制备

将复壮后菌株接种于BHIB 220rpm，28℃培养18h～24h，加入甲醛溶液并置于28℃条件下灭活48h，然后10℃条件下离心20min（6000rpm），用灭菌1×PBS洗涤3次，4℃保存备用。

取制备好的疫苗100μL分别涂布于BHIA、BA以及BHIB，28℃培养72h，进行灭活疫苗安全性检测。

（五）免疫接种

幼龄杂交鲟（♂×♀）（体重：（295±25）g；体长：（28±2）cm）购自河北保定某鲟鱼养殖场。暂养和试验用水为充分曝气的地下水，养殖条件为水温（20±2）℃，溶解氧6mg/L～8mg/L，每天投饵1次。

所有实验用鱼随机分成对照组、注射组和浸泡组，每组4个平行（10尾/组）。其中，注射免疫使用灭活菌的浓度分别为3.5×10cfu/mL、3.5×10cfu/mL和3.5×10cfu/mL（0.2mL/尾），对照组注射同体积生理盐水。浸泡免疫组使用灭活菌终浓度为3.5×10cfu/mL的疫苗浸泡20min，浸泡结束后转入无海豚链球菌水槽中饲养观察。

（六）血清抗体凝集效价

在免疫开始前和免疫后第7d、14d、21d和28d分别采集尾静脉血，血样室温下静置2h～3h后离心5min（5000r/min），取上层血清经56℃水浴灭活30min，后置于-80℃备用。用于测定抗体凝集效价。

（七）攻毒

在免疫第28d后进行攻毒实验，即将实验鱼置于海豚链球菌环境下（3.5×10cfu/mL）持续浸泡20min，连续观察14d，同时记录各组实验鱼死亡情况。实验结束后统计存活率，计算疫苗免疫的相对保护率（RPS，%）。

RPS（%）=（1-免疫组死亡率/对照组死亡率）×100

二、结果

（一）海豚链球菌致病特征及鉴定

经人工感染2d后，部分实验鱼体色发黑，游泳活力明显减弱，3d后实验鱼开始出现死亡，7d后平均累计死亡率达70%。患病鱼游动缓慢，口围和颊部出现血斑，肛门红肿，腹部膨大或体表出现点状出血或溃疡。解剖后发现其肝脏充血并有出血点，脾脏和肾脏明显肿大，肾呈紫黑色或严重糜烂不易剥离；肠道充血严重，肠壁变薄，肠道和腹腔中有积液，这些均为海豚链球菌致病典型特征（见图1）。与之相比，实验期间对照组实验鱼未出现死亡和病理症状。

图1 海豚链球菌感染杂交鲟致病症状

感染后从鱼体分离病原菌在血琼脂平板上28℃培养24h，菌落为圆形，中心白色，周边半透明，形成β溶血环。氧化酶阴性，触酶反应阴性，革兰氏染色阳性，卵圆形，呈链状或双排链状。经PCR扩增的16S rDNA基因片段约1500bp，测序后经Blast同源性检索，与海豚链球菌的同源性99.2%以上，确定即为海豚链球菌。

（二）LD50测定结果

接种海豚链球菌3d后实验鱼出现死亡，且随接种菌量增大死亡呈上升趋势，其中最高剂量组死亡率达90%，而最低剂量组死亡率仅为20%，对照组无死亡。据此计算菌株对杂交鲟半数致死量（LD）为3.9×10cfu/mL，详见表1。

表1 菌株对杂交鲟半数致死量

（三）免疫保护

各组实验鱼在攻毒第2d后均出现感染海豚链球菌临床症状，如肛门红肿，口腔周围充血，且解剖后从病鱼的脑、肝、脾、肾等组织中均能分离得到海豚链球菌。攻毒第3d后出现死亡现象，第7d后各组存活率分别为30%（对照组）、80%（3.5×10cfu/mL）、88%（3.5×10cfu/mL）、95%（3.5×10cfu/mL）和77%（浸泡组）（见图2）。随着注射疫苗浓度增大，免疫保护效果呈增加趋势，即3.5×10cfu/mL免疫组存活率最高为95%，其相对保护率（RPS）达到了92.8%，但注射免疫各组之间相对保护率无显著差异（＞0.05）。浸泡免疫组相对保护率（RPS）为67.1%，但与注射免疫各组间无显著差异（＞0.05）。实验结束后又继续观察7d，各实验组鱼均未出现死亡。

图2 各组实验鱼存活率（%）

从上述结果可以看出，尽管注射和浸泡免疫各组的免疫保护率均显著高于对照组（＜0.05），但是注射和浸泡免疫各组间的免疫保护率无显著差异（＞0.05），这说明注射和浸泡两种免疫方式均可对杂交鲟起到较好的免疫保护作用。

（四）血清抗体凝集效价

如表2所示，接种疫苗后第7d，各免疫组鲟鱼血清中的抗体效价较低，凝集效价≤1:8，注射免疫组到第14d时凝集效价显著升高，最高可达1:32。免疫第21d时，注射低浓度组（3.5×10cfu/mL）与浸泡组血清中凝集效价一致，均为1:16，注射中浓度组（3.5×10cfu/mL）和注射高浓度（3.5×10cfu/mL）血清中凝集效价分别为1:32和1:64。免疫第28d时，各免疫组血清凝集效价与第21d时一致。对照组血清凝集效价一致为零。结果表明，随着注射疫苗浓度的增加和免疫时间的延长，免疫组鲟鱼血清中凝集效价也随之升高，且免疫各组血清抗体凝集效价显著高于对照组（＜0.05），但注射组间以及各注射组与浸泡组间无显著差异（＞0.05）。

表2 菌株免疫组和对照组不同时间血清抗体凝集效价

三、讨论

为确保本研究中所用海豚链球菌毒力恢复以及抗原性完整，本研究首先将保存的海豚链球菌在健康杂交鲟中复壮。感染2d后，杂交鲟出现与自然发病基本一致的临床症状。然后再次分离到致病菌，经PCR扩增后测序比对分析，显示该菌即为海豚链球菌。复壮后的海豚链球菌对杂交鲟半数致死量浓度（LD）为3.9×10cfu/mL，与已报道杂交鲟海豚链球菌半数致死量浓度一致，表明该菌株经复壮后已经恢复致病毒力。

鱼类疫苗免疫方式有喷雾、口服、注射和浸泡，免疫次数可分为单次和多次连续免疫。针对海豚链球菌，国内外已有学者开展了灭活疫苗、减毒疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗对罗非鱼和牙鲆的研究。如美国研制的一种海豚链球菌灭活疫苗，以腹腔接种的方式免疫罗非鱼后，相对保护率可达90%以上；国内开展的罗非鱼腹腔注射免疫海豚链球菌灭活疫苗的免疫相对保护率为93.8%，而牙鲆源海豚链球菌Sip11重组亚单位疫苗注射免疫保护率可高达100%。本研究结果表明，海豚链球菌灭活疫苗腹腔注射和浸泡免疫保护效果显著高于对照组，最高浓度的注射免疫组和浸泡免疫组相对保护率分别达92.8%和67.1%，且随着注射灭活疫苗浓度的增加，其免疫保护效果也不断升高。

三个不同浓度的注射疫苗组之间的免疫保护效果并没有显著差异（＞0.05），并且注射免疫各组与浸泡免疫组间免疫保护效果也没有显著差异（＞0.05）。这表明本研究所制备的海豚链球菌灭活疫苗可以通过注射和浸泡两种方式提高对鲟鱼的保护效果，这些与已报道的其它鱼类海豚链球菌注射灭活疫苗相对保护率相近。

灭活疫苗免疫的鱼一般是基于体液免疫的免疫应答，产生抗体来中和、清除病原微生物和毒素，对细胞外感染病原微生物具有较好的免疫保护作用。另外，鱼类抗体形成比哺乳动物耗时长，在最佳温度下，接种后7d其血清中才逐渐出现免疫球蛋白。本研究中，随着免疫时间的延长，血清中凝集效价也随之升高，这与张生等已报道的海豚链球菌灭活疫苗免疫罗非鱼血清中产生抗体的凝集效价变化规律一致，且其免疫后最高凝集效价为1:64。

有研究发现通过两次注射免疫或者首次浸泡、二次注射免疫，可以显著提高免疫鱼血清中抗体的效价。关于浸泡免疫鱼血清中抗体凝集效价低于注射免疫鱼的原因，Nakanishi等认为浸泡免疫引起的免疫应答主要发生在鳃局部的黏膜组织中，而鱼类黏膜免疫系统可以不依赖免疫系统而独立完成特异性免疫应答，因此检测到血清抗体低并不意味着没有产生免疫应答。本研究中发现，浸泡组血清抗体效价低于中高浓注射度组，与低浓度注射组一致，但保护率与注射免疫各组无显著差异，也许正是因为上述原因。

本文研究结果表明，海豚链球菌灭活疫苗对杂交鲟具有较好的免疫保护效果，可为鲟鱼链球菌病防控技术研究提供理论依据，并为我国鲟鱼养殖产业健康发展提供保障。