QF-PCR技术应用于快速产前诊断额外检出母体性染色体数目异常3例报告

罗海艳，邹永毅，阳彦，陈佳，黄婷，刘艳秋

（江西省妇幼保健院产前诊断中心，江西 南昌 330006）

性染色体数目异常在可生育女性中存在着一定的发生率，其类型主要为嵌合型特纳综合征（Turner Syndrome，TS）与超雌综合征（Jacob Syndrome），临床上往往不表现出明显异常。但性染色体数目异常发生在生殖腺时有遗传给子代的风险[1]。定量荧光PCR（Quantitive fluorescent PCR，QF-PCR）是一项基于多态性短串联重复序列（Short tandem repeat，STR）进行多重PCR扩增并通过毛细管电泳以分析STR位点个性化信息的技术，应用于产前诊断不仅可实现对胎儿常见染色体21、18、13、X、Y数目异常的快速诊断，同时可获得孕妇上述常见染色体的信息，排除检测样本的母体细胞污染，并额外检出孕妇自身存在的性染色体数目异常，对提高孕妇染色体异常检出率与提供优生优育指导具有重要意义[2-4]。本研究报告了3例经QF-PCR快速产前诊断而额外检出的母体性染色体数目异常病例，对QF-PCR技术在额外检出母体性染色体数目异常中的临床应用进行了总结。

1 对象与方法

1.1 研究对象 孕妇1，26岁，G1P0，自然受孕，孕18周B超示正常妊娠，NIPT提示性染色体异常；孕妇2，32岁，G2P1，自然受孕，孕24周B超示羊水偏多及胎儿右锁骨下动脉迷走；孕妇3，20岁，G1P0，自然受孕，孕20周B超示正常妊娠，NIPT提示性染色体异常。3例孕妇均否认近1年内有输血史。获取充分知情同意后，于B超引导下对3例孕妇行羊水穿刺术采集羊水行产前诊断。同时抽取3例孕妇的外周血，对外周血与羊水行QF-PCR检测、以及羊水行CMA与核型分析，并对QF-PCR检测提示性染色体数目异常的孕妇行核型分析进一步验证。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 提取外周血、羊水基因组DNA，具体操作参照Qiagen血液组织DNA提取试剂盒说明书。

1.2.2 QF-PCR检测 采用QF-PCR快速诊断试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司）对21、18、13、X、Y染色体非整倍体数目异常进行检测。（1）STR位点：本研究中QF-PCR快速诊断试剂盒包含人类牙釉蛋白基因（Amelogenin，AMELXY）及14个STR位点，见表1。（2）PCR扩增与毛细管电泳：参照试剂盒说明书行PCR扩增（ABI 9700，Applied Biosystem，美国）与毛细管电泳（ABI 3500 DX，Applied Biosystem，美国）。（3）结果分析：使用GeneMapper ID 4.0软件分析毛细管电泳结果，判断标准遵照英国临床分子遗传协会（Clinical Molecular Genetics Society,CMGS）2012年新颁布的指南“QFPCR for the diagnosis of aneuploidy best practice guidelines(2012)v3.01”。

表1 21、18、13、X/Y染色体特异STR位点的遗传标记

1.2.3 CMA检测 参照Affymetrix芯片系统操作流程，取300 ng羊水gDNA用NspI酶随机消化，将消化产物末端补齐并与共同引物连接，连接处理后的样本行PCR扩增，产物大小为150～2000 bp，4%琼脂糖凝胶电泳确认产物条带。磁珠法纯化扩增产物，纯化产物由片段化酶处理为25～125 bp片段并连上生物素标记。标记产物与杂交液混匀变性后加载于750K芯片，置于Genechip hybridization oven 645杂交仪于50℃60 r/min条件下杂交16～18 h，随后于GeneChip@FluidiesStation 450Dx v.2洗涤工作站洗涤并染色。洗涤后的芯片于GeneChip@Scanner 3000Dx v.2 with AutoLoader扫描仪中扫描，获取数据并加载于配套ChAS v4.0软件后进行结果分析及判读。以上实验仪器均购自美国Affymetrix公司。

1.2.4 染色体核型分析 10 mL羊水1500 rpm离心10 min弃上清，重悬羊水细胞并接种至Amniopan培养基中，0.5 mL外周血接种至RPMI-1640培养基中。按照常规细胞培养制备染色体，320-400条带水平G显带，徕卡染色体核型扫描系统进行分析，镜下每例样本计数30个中期分裂相，分析10个核型，对疑似嵌合体或异常核型者再加数至100个分裂相，具体参照人类染色体命名的国际规则ISCN(2016)标准。

2 结果

3例孕妇的羊水样本未见母体细胞污染，QFPCR检测、核型分析、CMA检测显示3例胎儿未见检测范围内的染色体异常；QF-PCR检测显示3例孕妇存在性染色体数目异常，与外周血染色体核型分析结果一致。此处仅针对3例性染色体数目异常孕妇的QF-PCR与核型检测结果进行分析。

2.1 QF-PCR检测结果QF-PCR检测示孕妇1存在嵌合型性染色体数目异常，无法判断具体嵌合比例；孕妇2与孕妇3存在性染色体数目异常，提示为X三体，见图1。具体判读标准如下：（1）某一染色体上单个或多个STR位点出现多余等位基因峰（三体最多出现3个1:1:1等位基因峰）或双等位基因峰比率发生偏移（＜0.45或＞2.4），考虑嵌合体可能，需结合荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）或核型综合分析。（2）某一染色体上超过两个STR位点出现1:1:1三等位基因峰或1:2（0.45～0.65）、2:1（1.8～2.4）的双峰，且其他染色体STR位点检测无与之矛盾的结果，提示样本为该染色体三体。

图1 3例孕妇Q F-PCR检测结果示意图

2.2 核型分析结果 孕妇1外周血染色体核型分析结果为mos 47,XXX[79]/45,XO[21]，孕妇2和孕妇3外周血染色体核型分析结果为47，XXX，见图2，QF-PCR检测结果与外周血染色体核型分析结果一致。

图2 3例孕妇外周血染色体G显带核型分析图

2.3 妊娠结局随访 3例孕妇均足月顺产，3例胎儿出生时身高体重合格，阿氏评分为10分，后期将继续定期随访。

3 讨论

QF-PCR作为目前产前诊断的主流技术，具有检测速度快、自动化程度高的特点，对21、18、13、X、Y五组染色体非整倍体数目异常检出具有高度敏感性与特异性，可诊断出绝大部分的染色体数目异常疾病[5-6]。QF-PCR技术用于快速产前诊断中，能排除胎儿标本的母体细胞污染，快速检出胎儿常见的染色体数目异常，大大减少了孕妇及家属的心理负担，并根据STR位点信息可判断多余染色体的亲本来源，判断样本间亲缘关系与检出单亲二倍体（Unparental disomy，UPD）；此外，可获得孕妇上述常见染色体的信息并额外检出母体的性染色体数目异常，为遗传咨询提供更多指导。当然，QF-PCR用于快速产前诊断也具有一定的局限性，如对于非常见染色体的数目异常检测需选择特异性的STR位点，且对于上述五组染色体的结构异常及嵌合比例低于20%的染色体数目异常不敏感[13]。

特纳氏综合征与超雌综合征是女性常见的性染色体疾病[7-9]，完全型特纳氏综合征患者常由身材矮小，发育畸形、原发闭经，原发性不孕、第二性征发育不良等临床症状就诊而得到诊断[10]。嵌合型特纳氏综合征患者的临床表型常视正常细胞与异常细胞之间的比例不同而有所差异，45，XO细胞的比例越小则临床表现越近似正常个体[11]。大部分超雌综合征患者青春期月经正常且能正常生育，少数患者性器官发育不全，出现月经紊乱及早期绝经[12]。由于部分性染色体数目异常女性患者发育正常且具有生育能力，常常未能得到及时的检查与诊断，临床上很容易漏检，当该染色体异常发生在生殖腺时可遗传给子代而导致出生缺陷。本报道中3例孕妇由产前筛查未通过而行产前诊断，诊断结果表明3例胎儿未见检测范围内的染色体异常，孕妇1经QF-PCR检测提示为性染色体嵌合体，核型分析为47，XXX与45，XO的嵌合体（由于孕妇未同意，遂未行FISH检测该孕妇其它组织的嵌合比例），孕妇2与孕妇3经QF-PCR检测提示为X三体，核型验证结果与其一致。3例孕妇均未表现出明显智力与外貌异常，可自然妊娠，仅通过常规的产前诊断技术不能检出母体的性染色体数目异常而容易漏检。通过QF-PCR技术，不仅实现了对胎儿常见染色体非整倍体的快速产前诊断，降低了孕妇及家属的心理焦虑，而且经济快速地检出了上述3例孕妇自身存在的性染色体数目异常，为3例孕妇的优生优育提供了指导。考虑到3例孕妇均自身存在性染色体数目异常，我们建议其后续妊娠时直接行产前诊断。

综上所述，QF-PCR技术在快速产前诊断中具有重要的临床应用价值。与产前诊断中其它遗传学检测方法相比，QF-PCR不仅能实现对胎儿常见染色体数目异常的快速诊断及排除母体细胞污染，在额外检出母体性染色体数目异常方面，QFPCR更具有其独特的优势：QF-PCR在快速产前诊断中的应用提高了可生育女性中性染色体数目异常的检出率，对其后续生育指导具有重要意义。