抑制PERK/e IF2α通路对七氟醚诱发POCD大鼠内质网应激和α-突触核蛋白的影响

苗亚飞，杨木强，司马靓杰，闫俊强

（1.河南科技大学第一附属医院麻醉科，河南 洛阳 471003；2.河南科技大学第一附属医院神经内科，河南 洛阳 471003）

虽然七氟醚是一种稳定、安全的麻醉诱导剂，但是最近研究发现七氟醚会损伤神经元，诱发术后认知功能障碍（Postoperative cognitive dysfunction，POCD），甚至导致永久性的神经功能损伤以及帕金森症等[1]，α-突触核蛋白（α-Syn）是参与帕金森的重要蛋白，在POCD中也起着促进作用[2]。目前研究认为海马神经元受损是患者神经功能、记忆力减退的重要原因，而由各种原因引起的氧化应激反应和炎性反应会诱发海马神经元内质网应 激（Endoplasmic reticulum stress，ERS），进 而 导致神经元凋亡和功能障碍[3]。PERK/eIF2α通路是调节ERS的关键通路，并且有研究显示麻醉会引起PERK水平的升高，并且抑制ERS反应可缓解麻醉小鼠的POCD，并抑制神经元细胞凋亡[4]。本文主要分析抑制PERK/eIF2α通路对七氟醚诱发大鼠POCD、内质网应激和α-Syn的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 Sprague-Dawley（SD）大鼠（清洁级，雄性。20周，350～400 g，河南科技大学实验中心）。七氟醚（Abbvie公司，美国）。PERK/eIF2α通路抑制剂GSK2606414（Selleck公司，美国）。110 SE型小动物麻醉机（Ohmeda公司，美国）。水迷宫视频跟踪分析系统（泰盟科技有限公司，中国）。TUNEL凋亡试剂盒（碧云天公司，中国）。anti-PERK、anti-eIF2α、anti-Caspase-3、anti-CHOP、anti-α-Syn（Abcam公司，美国）。PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。ECL试剂盒（Amersham，美国）。显微镜（Olympus，日本）。

1.2 分组、建模和干预方法 24只SD大鼠随机分为对照组、七氟醚组和GSK2606414组（N=8）。七氟醚组和GSK2606414组参考文献通过七氟醚建立SD大鼠POCD模型[5]，主要步骤如下：SD大鼠禁食禁饮8 h后放置在连接麻醉机的大小为60 cm×30 cm×25 cm透明麻醉箱内，另一侧通道连接连接气体监测仪。七氟醚的麻醉浓度为2%，氧流量为3 L/min，连续4 h。对照组大鼠进行同样的处理但不吸入七氟醚。GSK2606414组大鼠根据参考文献[6]使用GSK2606414进行干预，在吸入七氟醚6 h前用GSK2606414灌胃，剂量为150 mg/kg，对照组和模型组给予等量的生理盐水灌胃。吸入七氟醚后4 h进行水迷宫实验和跳台实验，然后腹腔注射戊巴比妥（剂量为2 mL/kg，浓度为20 g/L）麻醉并处死大鼠，取出海马体进行后续试验。

1.3 Western blot检测蛋白 在液氮下将海马体研磨并用预冷的PBS缓冲液洗涤，裂解后萃取总蛋白，将蛋白样本与角质酶II混合并进行SDSPAGE分离蛋白，经转膜后封闭，在PDVF膜中加入anti-PERK、anti-eIF2α、anti-Caspase-3、anti-CHOP、anti-α-Syn（1:500稀释）在4°C孵育过夜，然后加入1∶5 000稀释的二抗（1 h，室温）。ECL试剂盒可视化蛋白条带，以GAPDH为内参对蛋白条带的灰度进行定量。纹状体中α-突触核蛋白水平检测方法与此相同。

1.4 水迷宫实验和跳台实验检测神经功能和学习能力 通过水迷宫视频跟踪[7]和跳台实验[8]检测进行检测。对于水迷宫实验，逃避潜伏期越长、穿越平台次数越低提示神经功能损伤越严重。对于跳台实验，学习期和实验期错误次数越高、潜伏期越长提示学习能力越差。

1.5 TUNEL染色检测凋亡 将海马体组织固定并透化，根据试剂盒说明书进行操作，然后将其放置于TUNEL溶中，在37℃下孵育1 h。洗涤后加入Converter-POD溶液孵育30 min。之后依次进行显色、DAPI染色细胞核，然后进行封片。通过检测荧光反应计算凋亡率。

1.6 统计学处理 所有实验设立3个平行实验。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。 统计分析使用SPSS 19软件。 进行单因素方差分析，两两比较使用LSD-t检验。 统计学显着性表示为P＜0.05。

2 结果

2.1 GSK2606414对PERK/eIF2α通路的影响 七氟醚组的PERK和eIF2α水平显著高于对照组（P＜0.05），GSK2606414组的PERK和eIF2α水平显著低于七氟醚组（P＜0.05），提示GSK2606414可有效抑制PERK/eIF2α通路，见表1、图1。

表1 各组PERK/e IF2α通路比较

图1 Westernblot检测GSK2606414对PERK/e IF2α通路的影响

2.2 GSK2606414对神经功能和学习能力的影响与对照组比较，七氟醚组的逃避潜伏期、错误次数和潜伏期显著升高而穿越平台次数显著降低（P<0.05），GSK2606414组的逃避潜伏期、错误次数和潜伏期显著低于七氟醚组穿越平台次数显著高于七氟醚组（P<0.05），见表2。

表2 各组水迷宫实验结果和跳台实验结果比较

2.3 GSK2606414对海马神经元凋亡的影响 如图2，蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为凋亡细胞。对照组海马神经元凋亡率为（1.25±0.35）%，七氟醚组的凋亡率为（16.23±2.85）%，显著高于对照组，GSK26 06414组凋亡率为（7.83±1.68）%，显著低于七氟醚组（P<0.05）。

图2 TUNEL检测GSK2606414对海马神经元凋亡的影响

2.4 GSK2606414对内质网应激和α-Syn水平的影响 七氟醚组海马体组织的CHOP、Caspase-3和α-Syn水平显著高于对照组（P<0.05），GSK2606414组的CHOP、Caspase-3和α-Syn水平显著低于七氟醚组（P<0.05），见表3、图3。

表3 各组内质网应激和α-S y n水平比较

图3 Western blot检测GSK2606414对内质网应激和α-Syn水平的影响

3 讨论

近年来，外科手术得到了迅猛发展，患者对于手术安全性和舒适性的也要求提高，七氟醚具有快速诱导麻醉、对肝和肾功能影响小及稳定的血液动力学等特点，在麻醉中广泛使用。但是过往研究已经发现了七氟醚在中枢神经系统中的作用，可能会出现POCD，甚至影响儿童的智力和记忆力，引起帕金森症等，分析POCD的发病机制具有重要意义[9]。

海马体神经元的损伤是引起术后认知功能障碍的主要原因，研究显示七氟醚会引起海马体神经元凋亡，从而引起POCD[10]。氧化应激反应在其中起着重要作用，研究显示七氟醚可以通过调节氧化应激引起海马体神经元凋亡[11]。PERK/eIF2α通路与氧化应激密切相关，研究显示PERK/eIF2α通路的激活与POCD有关[12]。七氟醚也具有激活PERK/eIF2α通路的作用[13]，据此我们推测七氟醚可能通过PERK/eIF2α通路参与POCD的发生。在本次研究中，我们通过吸入七氟醚建立大鼠POCD模型，然后通过GSK2606414抑制PERK/eIF2α通路。结果显示模型组大鼠海马体中PERK/eIF2α水平显著升高，而GSK2606414可以显著一直POCD大鼠的PERK/eIF2α通路。此外，七氟醚组的PERK/eIF2神经功能和学习能力降低，海马体的细胞凋亡率，GSK2606414组神经功能和学习能力高于七氟醚组，海马体的细胞凋亡率低于七氟醚组。这提示在七氟醚引起的POCD大鼠模型中，PERK/eIF2α通路被激活，而抑制PERK/eIF2α通路可以缓解七氟醚对海马体凋亡和神经功能、学习能力的影响。

为进一步分析PERK/eIF2α通路在七氟醚引起的POCD大鼠模型中的作用机制，检测了ERS和α-Syn的水平。PERK/eIF2α通路可以直接调节ERS，ERS是是细胞对外界压力或损伤的早期或初始反应，并与神经元损伤或死亡有关，如阿尔茨海默症、帕金森症等，研究显示了氧化应激引起的ERS与老年患者POCD[14]。而PERK/eIF2α通路的激活也会引起α-Syn的上调，也会参与ERS[15]。本次研究结果显示与对照组比较，七氟醚组的α-Syn和质网应激标志蛋白CHOP、Caspase-3水平显著升高，GSK2606414组α-Syn、CHOP、Caspase-3水平显著低于七氟醚组。有研究显示七氟醚会通过调节PERK/eIF2α通路引起超结构ER交替和ER应激活化，而ERS会促进CHOP、Caspase-3蛋白的升高，引起凋亡[16]。α-Syn与脑部神经元的损伤密切相关，研究显示α-Syn可以倍七氟醚和PERK诱导，抑制ERK/eIF2α通路会减少α-Syn的表达保护脑神经[17-18]。本次研究结果显示抑制PERK/eIF2α通路可以抑制七氟醚引起的海马体ERS和α-Syn的表达。

综上所述，七氟醚会引起PERK/eIF2α通路、ERS和α-Syn的上调，而抑制PERK/eIF2α通路会显著抑制ERS和α-Syn的表达，缓解海马体神经元的凋亡。但是关于吸入七氟醚通过PERK/eIF2α通路调节ERS和α-Syn的机制仍需要进一步研究。