鄱阳湖流域河湖口微生物多样性研究

褚奇奇，徐广昌，黄 晶，简正军，秦泰春，欧阳乐乐，黄小兰*

（1.东华理工大学 地球科学学院，江西 南昌 330013；2.江西省赣州市水利局，江西 赣州 341000；3.江西省国土空间调查规划研究院，江西 南昌 330001；4.江西师范大学 地理与环境学院，江西 南昌 330022）

0 引言

鄱阳湖地处长江中下游的南岸，是我国第一大淡水湖泊，也是季节性、吞吐型湖泊［1］。鄱阳湖在1年内的水位与湖面积变化很大，水位变幅为9.59～15.36 m，最大湖面积约为3841 km2，最小湖面积约为526 km2。鄱阳湖具有“洪水一片，枯水一线”的地理特征［2］。鄱阳湖微生物的多样性受水体环境的影响较大，水环境效应在鄱阳湖流域河湖生态系统中发挥着重要的作用。对鄱阳湖水环境的相关研究主要集中在氮、磷的时空分布［3］、土地利用方式对水质的影响［4］以及重金属的分布［5］等方面。在水体微生物方面，唐婧等［5］研究发现河流水质的变化会引起河流细菌群落结构的改变；吴兰等［6］对鄱阳湖水体的细菌群落组成及遗传多样性进行了研究。河流入湖口地段是鄱阳湖流域内河流生态系统与湖泊生态系统之间生态较为敏感的区域，是水体污染物缓冲区和净化区的重要区域，受到了学者们的特别关注，但是关于河流入湖口微生物群落结构和组成的研究比较缺乏。鉴于此，本研究采用高通量测序技术分析了鄱阳湖河湖口的微生物群落组成，探讨了微生物群落组成与环境因子的关系，明确了鄱阳湖河湖口微生物的多样性，研究结果可以为鄱阳湖流域的水资源利用、水环境保护及水环境治理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 采样点位的情况

在枯水期选取鄱阳湖河湖口具有代表性的5个点位和1个瑶湖点位采集水样，采样点位的定位使用手持式GPS（GPSmap 62sc，美国Garmin公司）完成。所选的6个采样点位依次是：望湖亭赣修交汇处（WH）、大湖池观鸟亭附近（修水）（DH）、瑶湖（YH）、矶山（赣江支流）（JS）、饶河（昌江与乐安河交汇处）（RH）、湖口县湖口渡口（长江河湖口）（HK）。

1.2 水样的采集及预处理

在每个点位使用无菌聚乙烯瓶按微生物多样性分析的采样标准采集2 L水样，在实验室经过2级滤膜过滤，一级是0.85 μm滤膜，另一级是0.45 μm滤膜；然后将0.45 μm滤膜放入已消毒的试管中，冻存在-80 ℃以下，用于测定样品中的DNA。同时在每个点位采集500 mL的水样，用来测定其理化性质。另外在现场使用pH仪和水温探头测定水样的pH值和水温。

总氮（TN, Total Nitrogen）和总磷（TP, Total Phosphorus）含量的测定分别使用凯氏定氮法和钥酸钱分光光度法［7］。

1.3 水样DNA提取和高通量测序

使用E.Z.N.A.®DNA Kit试剂盒提取各点位水样的微生物基因组DNA，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA产物。使用引物338F（5′-ACT CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′）通过PCR扩增16S rRNA基因的V3～V4高变区［8］。委托华大基因公司进行高通量测序。

1.4 数据处理及统计分析

利用Mothur V 1.43.0软件对样品的原始DNA序列进行质控过滤，去除嵌合体，并将序列相似度≥97%的序列归类为同一分类操作单元（OTU,operational taxonomic unit）。基 于QIIME软 件 计 算的Shannon、Simpson、Ace和Chao 1指数来研究微生物群落的多样性特征。利用Excel、SPSS等数据处理软件分析微生物群落组成。采用IBM SPSS Statistics 24软件进行相关性分析。利用Canoco软件进行冗余分析（RDA, redundancy analysis）。

2 结果与分析

2.1 水样理化指标分析

鄱阳湖入湖口各点位水样的温度、pH值、TN含量和TP含量如表1所示，各点位的水温在11.7～16.9 ℃之间，平均水温为14.0 ℃；水样的pH值介于7.01～8.01之间；TN含量在5.65～22.70 mg/L之间，以JS点位的TN含量最高，以HK点位的TN含量最低；TP含量在0.052～0.230 mg/L之间，以HK点位的TP含量最高，以JS点位的TP含量最低。根据《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）［9］，各点位水样的TN含量超出了国家Ⅴ类标准（＜2.0mg/L），TP含量在Ⅱ～Ⅳ类标准（≤0.1 mg/L，＜0.2 mg/L，≤0.3 mg/L）之间波动。根据江西省环境监测中心站［10］近10年对鄱阳湖环湖河流10个断面TN、TP含量的监测数据，TN含量呈上升趋势，TP含量在Ⅱ～Ⅲ类之间波动，这与本研究检测结果反映的情况基本一致。

表1 鄱阳湖入湖口各点位水样的理化性质

2.2 微生物群落组成

如图1所示，在门分类水平上，群落平均相对丰度≥1%的门类为变形菌门（Proteobacteria，相对丰度为27.80%～81.04%，下同）、放线菌门（Actinobacteria，2.47%～42.84%）、蓝细菌门（Cyanobacteria，1.05%～27.14%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，2.51%～16.49%）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae，0.26%～1.05%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，0.70%～3.46%）、酸酐菌门（Acidobacteria，0.23%～4.59%）、绿弯菌门（Chloroflexi，0.39%～2.79%），平均占比分别为50.44%、21.97%、13.93%、6.31%、2.34%、1.77%、1.69%、1.24%。这说明鄱阳湖河湖口各点位水样的细菌丰富度存在差异，主要以变形菌门和放线菌门的细菌为优势菌。变形菌门中含量大于50%的有超过1/2的点位，其中HK（81.04%）点位的含量最高，YH（27.80%）点位的最低；放线菌门中WH（42.84%）点位的含量最高，DH（2.47%）点位的最低；蓝细菌门中DH（27.14%）点位的含量最高，HK（1.05%）点位的含量最低；含量差异非常显著的是拟杆菌门，JS（2.51%）点位的含量最低，DH（16.49%）点位的含量最高；总体差异较小的是疣微菌门，各点位的含量基本上都小于2%。

图1 在门分类水平上水样微生物群落的组成

2.3 微生物多样性分析

利用Miseq测序技术研究鄱阳湖河湖口水样的微生物群落分布，结果从6个点位的水样中共得到了172462条有效序列，平均序列长度为439.60 bp；拼接的Tags经过优化后，在0.97相似度［11-12］下将其聚类为用于物种分类的OTU，6个样品共产生了5166个OTU。其中WH（1089）、DH（1047）、JS（926）的OTU数量较多，而RH（728）、HK（795）、YH（581）的OTU数量较少（图2）。

图2 各点位水样的OTUs Venn图

反映微生物群落丰富度和多样性的重要参数是α多样性，其常用的衡量指标有Chao 1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数。从表2可以看出：Ace指数最高的点位为WH，其次为DH、HK、JS、RH，最低的点位是YH；Chao 1指数最高的点位为WH，其次为DH、HK、JS、RH，最低的点位是YH，这说明WH、DH点位水样的细菌丰富度较高，而YH点位水样的细菌丰富度最低。虽然Chao 1指数和Ace指数的计算方法不同，但两者表征的群落丰富度的趋势基本一致。Shannon指数和Simpson指数均是反映α多样性的指数，当微生物多样性较高时，Shannon指数较大；Simpson指数越大，说明微生物多样性分布越均匀。在表2中，JS和WH点位水样的Simpson指数较低，HK、DH点位的Simpson指数较高，YH点位的Simpson指数最高，这表明交汇口处的细菌群落较为丰富，而鄱阳湖湖区、瑶湖及赣江的细菌群落丰富度较小。

表2 不同点位水样的细菌群落的多样性和丰富度

2.4 微生物多样性指数与水体理化性质间的相关性分析

利用SPSS软件对微生物群落多样性指数与水体理化性质进行Spearman相关性分析，结果（表3）表明：Shannon指数与水体TN含量呈显著正相关，与水体TP含量呈显著负相关；Simpson指数与水体TP含量呈极显著正相关；水温、pH值与微生物多样性指数均具有一定程度的相关性，但均未达到显著水平。因此，水体的TP和TN含量是影响微生物多样性的2个关键因素。

表3 水样微生物多样性指数与理化性质之间的相关系数

2.5 微生物群落组成与水体理化性质间的相关性分析

对微生物群落门水平组成与水体理化性质进行冗余分析。结果（图3）显示：在第1排序轴（70.15%）和第2排序轴（24.20%）共计解释水体细菌结构变异的94.35%，表明前2轴的贡献率可以很好地解释水体理化性质对水体微生物群落结构的影响。从图3还可以看出：变形菌门与TN、TP含量呈显著正相关，与TN含量、pH值呈显著负相关；放线菌门与pH值呈显著正相关，与TN含量呈显著负相关；拟杆菌门、蓝细菌门与Hg、TN含量呈显著正相关。从整体来看，影响鄱阳湖入湖口水体微生物群落组成的主要环境因子是水温（P=0.411）、TN含量（P=0.372）和TP含量（P=0.733），而pH值（P=0.197）和Hg含量（P=0.299）的影响较小。

图3 水体微生物群落组成与理化性质的冗余分析结果

3 讨论

本研究发现鄱阳湖河湖口的优势微生物群落主要由变形菌(Proteobacteria， 50.44%)、放线菌(Actinobacteria， 21.97%)、蓝细菌(Cyanobacteria，13.93%)、拟杆菌(Bacteroidetes， 6.31%)、疣微菌(Verrucomicrobia， 1.77%)、绿 弯 菌(Chloroflexi， 1.24%)及硝化螺旋菌(Nitrospirae， 2.34%)等优势菌群组成。在本研究中，采样点位DH位于修水与鄱阳湖的交汇处，JS位于赣江支流与鄱阳湖交汇处，这2个点位均位于不同河流与鄱阳湖的交汇处，人类活动密集，水体中TN含量较高，其理化指标比地理位置对细菌群落组成的影响更大。王鹏等［14］利用高通量测序方法发现赣江南昌段在夏季的优势微生物类群为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门。任丽娟等［15］研究发现在湖泊中，典型的淡水细菌门类有21种，其中主要为变形菌门、蓝细菌门、拟杆菌门、放线菌门和疣微菌门。杜瑞芳等［16］发现在乌梁素海湖滨湿地微生物群落中，优势菌门为变形菌门，其相对丰度达78.6%。江玉梅等［17］发现鄱阳湖水体和底泥沉积物中相对丰度最高的是变形菌。上述研究结果均表明变形菌门在湖泊中分布广泛，对不同生态环境的耐受力较强，这与本研究结果相符。位光山等［18］发现河海交汇处和近陆处的微生物群落组成差异明显。本研究也发现了类似的现象。

在生态系统中，各种环境因子之间的关系复杂［20］，河流微生物受到营养物质、重金属污染、气候、水文条件等众多环境因子的影响［21］。本文应用Canoco软件对微生物和环境因子进行冗余分析，发现TN、TP含量和pH值是影响鄱阳湖河湖口水体微生物多样性的主要理化因子。Xiu等［22］通过克隆基因文库的方法研究了黄河表层水面和沉积物的细菌群落特征，发现影响细菌群落特征的主要影响因子是pH值、DOC和含沙量。庞兴红等［22］研究了太湖夏季浮游细菌群落多样性特征与水体营养盐的关系，发现TP含量与细菌丰富度呈较好的正相关，不同湖区营养盐与浮游细菌群落多样性也呈显著正相关。本研究发现，赣江入湖口水体存在较为严重的富营养化现象；在门分类水平上蓝细菌门的含量平均高达13.93%，在点位DH和YH蓝细菌门的含量较高，这2个点位水体细菌群落的多样性较低是因为水体中蓝细菌大量繁殖压缩了其他细菌的生存空间。冯胜等［23］的研究表明太湖富营养化湖区的微生物多样性也较低，可见影响微生物群落分布的因子复杂多样。

4 结论

赣江支流与鄱阳湖交汇处（JS）水体中TN含量最高，其次为修水与鄱阳湖交汇处（DH），这2个采样点位水体污染较严重。长江入湖口与鄱阳湖交汇处（HK）水体TP含量最高，其次为瑶湖（YH）。鄱阳湖河湖口微生物群落组成主要有变形菌门、放线菌门、蓝细菌门、拟杆菌门、疣微菌门。影响鄱阳湖河湖口水体微生物多样性的主要环境因子是水温、TN含量和TP含量。