3种植物生长调节剂对高山杜鹃组培苗保存的影响

李莎莎，李雪娇，赵正雄，解玮佳，李世峰，宋 杰，张 露，彭绿春，*

（1.云南农业大学，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院 花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心/云南省花卉育种重点实验室/云南花卉技术工程研究中心，云南 昆明 650205）

0 引言

杜鹃花属(RhododendronL.)是世界著名的木本花卉，其花冠硕大、颜色鲜艳，观赏价值高，是近年来中国年宵花和高档园林造景的新秀，市场前景较好［1，2］。杜鹃通常采用嫁接、扦插、播种等方法繁殖［3］，但这些繁殖方法会受母株材料、季节等因素的影响且工作量大，不宜进行大规模生产。杜鹃组织培养体系的建立不仅可以加快繁殖速度，而且不受季节影响，对杜鹃的引种和规模化、商业化生产具有重要意义［4］。在试管苗继代保存过程中，随着培养基中营养物质耗尽和失水干裂，需将试管苗接种到新的培养基中，但多次继代繁殖会导致组培苗繁殖能力下降，变异概率提高，同时也增加了繁琐的人工操作过程［5］，因此，通过添加植物生长调节剂来延缓植物生长以减少继代培养的次数，对杜鹃种质资源的保存具有重要意义。

在高山杜鹃的生产过程中，新品种培育和种质保存日益受到关注，植物种质资源离体保存主要是利用生物技术，在无菌培养条件下，通过添加各类生长抑制剂，使植物生长延缓或停止，减少继代次数，以达到长期保存的目的［6］。植物离体保存技术包括缓慢生长离体保存和超低温离体保存2种［7］，缓慢生长离体保存是在常规培养条件下对培养材料限制生长的保存方法，保存时间较短，需定期继代；超低温保存是指在-80 ℃以下的温度（一般用液氮）对植物种质资源进行保存，超低温保存一般有4种方法，即玻璃化法超低温保存、小滴玻璃化法超低温保存、包埋玻璃化法超低温保存和包埋脱水法超低温保存［8-9］，无需继代，品种不容易发生变异［10］，但超低温保存植物的生长恢复周期较长。

植物生长调节剂是由人工合成用于调节植物生长发育的化学物质，对植物生长具有重要的调控作用，可以促进插条生根、控制株形、调控花期、提高抗逆性，并且还能解除休眠，增加分蘖和分球数目，提高繁殖率［11-12］。在果蔬作物、农业经济作物和观赏植物等方面的应用较广。王晓蔓等［5］在苹果组培苗的继代培养基中加入不同浓度的B9、矮壮素、PP333及脱落酸，结果表明：B9、矮壮素均有明显的抑制作用，且茎尖存活率高，试管苗生长状况较好；蒋元斌［13］用B9、PP333和ABA分别对芋头种质进行离体保存，结果表明：3种植物生长延缓剂均能有效提高芋头试管苗的成活率；晋玲等［14］用ABA、PP333保存秦艽愈伤组织取得了较好的效果；赵云龙等［15］用不同浓度的B9、PP333均可延缓大白杜鹃的生长；解玮佳等［16］用不同浓度的矮壮素、PP333处理高山杜鹃，均可使其分枝变短增粗，延缓其生长；顾地周等［17］采用添加根皮苷的试管保存方法，结果表明：在试管内采取延缓生长法保存牛皮杜鹃丛生芽团是切实可行的新方法。

目前，对杜鹃组培苗延缓生长保存的研究较少，为了探索植物生长调节剂对高山杜鹃生长和抗逆性的影响，本文以2种高山杜鹃组培苗为材料，研究不同浓度的植物生长调节剂对高山杜鹃组培苗种质延缓生长保存的影响。为种质保存中减少继代培养的次数、提升种苗品质和炼苗移栽成活率等方面提供借鉴参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试的高山杜鹃组培苗为红粉佳人、诺娃，培养条件：光照强度2000 lx，光照时间12 h/d，培养温度（25±2） ℃。选用的植物生长调节剂为根皮苷、B9、PP333。试验于2020年9月—2021年6月在云南省农业科学院花卉研究所组织培养实验室内进行。

1.2 试验方法

以增殖培养30 d且长势一致的高山杜鹃瓶苗为试验材料，切取植株顶部往下约2 cm的茎段，分别接种于添加了不同浓度根皮苷、B9、PP333的继代培养基中，继代培养基为WPM+1 mg/L ZT+0.05 mg/L NAA，pH值为5.4。3种生长调节剂均分别设置5个浓度梯度，根皮苷浓度分别为0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，B9浓度分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，PP333浓度分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，均以浓度0 mg/L作为空白对照，每个浓度设3个重复，每个重复接种15个带顶芽茎段。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 形态指标的测定 将高度一致的杜鹃组培苗接入含有相应生长调节剂的继代培养基中，用直尺测量培养基表面以上的植株高度，记为h1；3种生长调节剂处理90 d后，测量培养基表面以上的植株高度，记为h2，计算公式如下：

生长量(cm)=h2-h1

恢复出芽率(%)=植株恢复生长后萌发的新芽数/延缓生长后接入普通继代培养基中的植株数×100%

1.3.2 生理抗逆指标的测定 3种生长调节剂处理90 d后，分别从对照及各个处理的每个重复中，随机取0.5 g植株，进行可溶性蛋白质含量、丙二醛含量（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和叶绿素含量等生理指标的测定，具体操作方法参照试剂盒说明书，以上试剂盒均购买自上海优选生物科技有限公司。

1.4 恢复生长

3种生长调节剂处理90 d后，将处理后的试管苗转接到继代培养基中进行恢复培养，观察并统计生长情况。

1.5 数据处理

原始数据用Excel软件进行统计分析，采用SPSS 18.0软件分析不同处理间分化率和分化不定芽数的差异显著性，显著水平P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 不同生长调节剂对高山杜鹃形态的影响

由图1可知，与对照相比，经根皮苷处理90 d后的2种高山杜鹃植株的生长量显著降低，试管苗节间缩短，茎秆粗壮（图1B、图1F），诺娃植株有一定的矮化效果，部分叶片皱缩变红；经B9处理90 d后红粉佳人的矮化效果与其对照植株（图1A）相比差异不显著（图1C），诺娃植株上部分叶片变红（图1G）；经PP333处理90 d后2种高山杜鹃植株的矮化效果较对照最为显著（图1D、图1H），红粉佳人植株的叶片亮绿，生长状况良好，诺娃植株部分叶片变红，顶芽生长受到抑制，顶部有部分叶片出现萎蔫现象。

图1 3种生长调节剂处理对2种高山杜鹃形态的影响

2.2 根皮苷对高山杜鹃组培苗延缓生长的影响

由表1可知，经不同浓度根皮苷培养90 d后，2种高山杜鹃的生长量较对照显著降低，矮化效果显著，表现出明显的抑制生长作用，其中诺娃的矮化效果更显著。红粉佳人的生长量在根皮苷浓度介于1.5～2.5 mg/L范围时，逐渐降低，浓度至2.5 mg/L时最低，矮化效果最显著，浓度为3.0 mg/L时其生长量又快速增至最大，此时无矮化效果；添加根皮苷对红粉佳人的恢复出芽率存在不同程度的抑制作用。根皮苷处理中诺娃的生长量显著低于对照，并且随根皮苷浓度的增加，生长量显著降低，在根皮苷浓度为1.5 mg/L时明显的无矮化效果，当根皮苷浓度介于2.0～3.0 mg/L范围时，其生长量随着浓度升高而显著降低，当浓度为3.0 mg/L时其生长量降至最低，此时矮化效果最显著，而诺娃的恢复出芽率随着根皮苷浓度增加而提高。

表1 不同浓度的根皮苷处理对2种高山杜鹃组培苗生长的影响

由表2可知，随着根皮苷浓度的增加，红粉佳人的可溶性蛋白含量略微降低，但较对照均无显著性差异；MDA和叶绿素含量以及SOD活性随根皮苷浓度的增加而提高，其中根皮苷浓度为2.5 mg/L时的MDA含量和SOD活性显著高于0～2 mg/L的处理，根皮苷浓度3 mg/L时，MDA含量和SOD活性下降，但与2.5 mg/L的处理差异不显著；根皮苷浓度为2 mg/L时叶绿素含量显著高于0～1.5 mg/L的处理，之后下降但与2 mg/L的处理差异不显著。随着根皮苷浓度的增加，诺娃的可溶性蛋白含量，与对照相比无显著性差异；MDA含量、SOD活性、叶绿素含量均随着根皮苷浓度的升高而增加，当根皮苷浓度为3.0 mg/L时的含量均达到最高，较对照及其他处理具有显著性差异；综上所述，适合红粉佳人和诺娃延缓生长保存的根皮苷浓度分别为2.5和3.0 mg/L。

表2 不同浓度的根皮苷对2种高山杜鹃组培苗生理指标的影响

2.3 B9对高山杜鹃组培苗延缓生长的影响

由表3可知，与对照相比，在B9浓度介于1.0～2.0 mg/L时，红粉佳人的生长量逐渐增加，无矮化效果；当浓度为2.5 mg/L时，其生长量最低，矮化效果最显著，恢复出芽率随B9浓度增加而升高。在B9浓度介于2.0～2.5 mg/L时，诺娃的生长量逐渐减少且显著低于对照，当浓度为2.5 mg/L时，其生长量达到最低，矮化效果最显著，恢复出芽率随B9浓度增加而不断升高。

表3 不同浓度B9对2种高山杜鹃组培苗生长的影响

由表4可知，除了B9浓度为1.0与2.0 mg/L之间的差异显著外，红粉佳人其他各处理之间的可溶性蛋白含量无显著性差异；MDA含量、叶绿素含量及SOD活性随B9浓度的增加而升高，当B9浓度为1.5、2.0和2.5 mg/L时，其MDA含量和SOD活性无显著差异，且均显著高于对照，当B9浓度为2.5 mg/L时，叶绿素含量显著高于对照。诺娃的可溶性蛋白含量无明显提高，不同浓度B9处理与对照相比无显著性差异；MDA含量、SOD活性、叶绿素含量随着B9浓度的升高而增加，浓度为2.5 mg/L时含量均达到最高，较对照均具有显著性差异。综上所述，适合红粉佳人和诺娃延缓生长保存的B9最佳浓度均为2.5 mg/L。

表4 不同浓度B9对2种高山杜鹃组培苗生理指标的影响

2.4 PP333对高山杜鹃组培苗延缓生长的影响

由表5可知，红粉佳人和诺娃的生长量在5个PP333浓度处理下均大幅降低，显著低于对照，且各浓度处理下的生长量之间无显著差异，说明PP333对2种高山杜鹃植株矮化的作用浓度低；而红粉佳人和诺娃的恢复出芽率均是随PP333浓度增加而提高。

表5 不同浓度PP333对2种高山杜鹃组培苗生长的影响

由表6可知，随着PP333浓度的增加，红粉佳人的可溶性蛋白含量有所下降，但各处理之间与对照无显著性差异；MDA含量、SOD活性均随着PP333浓度的增加而提高，均在浓度为2.5 mg/L时达到最高，较对照差异显著；叶绿素含量在1.0～1.5、2.0～2.5 mg/L这2个浓度梯度处理下增加，在浓度为2.5 mg/L达到最高。随着PP333浓度的增加，诺娃的可溶性蛋白含量与对照相比无显著性差异；MDA含量、SOD活性、叶绿素含量均随着PP333浓度的升高呈现波动上升的变化趋势，在浓度为1.0 mg/L时达到最高，较对照均具有显著性差异。综上所述，红粉佳人最佳的PP333处理浓度为2.5 mg/L，诺娃最佳的PP333处理浓度为1.0 mg/L。

表6 不同浓度PP333对2种高山杜鹃组培苗生理指标的影响

3 结论与讨论

2种高山杜鹃在延缓生长保存期间，根皮苷、B9、PP333均能明显抑制杜鹃组培苗的生长，在对照及各浓度处理间，可溶性蛋白含量无显著差异，而与对照相比，SOD活性、 MDA、叶绿素含量呈现一定的差异性变化，其中，SOD活性、叶绿素含量随生长调节剂浓度的增加而提高，且各个处理之间存在显著差异。延缓生长保存的组培苗转入继代培养基后当代即可恢复生长。本研究筛选出红粉佳人最适宜的3种生长调节剂的浓度为根皮苷2.5 mg/L、B92.5 mg/L、PP3332.5 mg/L；诺娃最适宜的浓度为根皮苷3.0 mg/L、B92.5 mg/L，PP3331.0 mg/L，且3种生长调节剂对诺娃的处理效果明显优于对红粉佳人。

延缓生长保存法可以避免频繁继代造成污染或引发种质变异，从而有效地保证种质的遗传稳定性，达到植物种质资源中期保存目的［18］。向培养基中添加适宜质量浓度的植物生长延缓剂是植物组织培养物缓慢生长保存的有效方法［19］。植物生长延缓剂是通过抑制赤霉素的生物合成来抑制植物顶端分生组织的生长，从而延缓植物的生长［20］。研究表明，调整培养基中植物生长延缓剂的种类和比例，不仅能延长培养物在试管中的保存时间，而且能提高试管苗的素质和移植成活率。培养基中添加生长延缓剂，可达到延缓生长、延长保存时间的目的，方法简单，每隔半年以上转接1次可实现一定时间的保存，但在实际工作中，针对不同品种的试管苗，不同植物生长延缓剂或抑制剂的效果也会有所差异。同一种抑制剂应用在不同的植物中，效果也不一样。

根皮苷、B9、PP333等作为高效、低毒的植物生长调节剂，在试管苗的延缓生长保存中效果较好且应用比较广泛。但不同生长延缓剂对不同种类试管苗的抑制作用有所不同，顾地周等［17］采用添加根皮苷的培养基进行杜鹃组培苗的延缓保存，研究表明：在试管内采取延缓生长法保存牛皮杜鹃丛生芽团是切实可行的。赵喜亭等［18］研究表明PP333、B9均可延缓怀山药试管苗的生长，PP333的保存效果优于B9。艾辛等［21］研究表明：在MS培养基中添加4.80 mg/L PP333时，马铃薯脱毒试管苗保存时间最长可达到300 d。王家福等［22］在枇杷种质资源离体保存试验中证明，浓度介于2～5 mg/L的PP333有抑制枇杷试管苗生长的作用。董志君等［23］研究表明：施用PP333可有效矮化芍药，以上研究结果均与本研究试验结论一致。

本研究通过对2种高山杜鹃组培苗生理指标的测定分析，发现3种生长调节剂在延缓高山杜鹃组培苗生长的同时，也提高了高山杜鹃渗透调节物质的含量和抗氧化酶的活性，并增强其抗逆性，与朱茂成等［24］对米老排幼苗、冯斗等［25］对甜高粱幼苗的研究结果一致。但目前关于高山杜鹃方面的相关研究仍较少。