基于网络药理学探讨二妙散治疗湿疹的作用机制※

徐小港 王钰 徐义峰 章德林

湿疹（eczema）是一种临床常见的炎症性皮肤病，可侵及人体真皮浅层及表皮[1-2]，以丘疹、糜烂、渗出及瘙痒为主要症状，具有对称性、反复发作性、多形损害等特点，严重影响患者的生活质量。本病好发于婴幼儿和青少年，调查显示，1～7岁儿童湿疹的粗患病率为12.94%，与早产、被动吸烟、营养不均衡等因素密切相关[3]。目前，西医主要采用糖皮质激素、抗组胺药、免疫调节剂等对症治疗，短期收效显著，长期使用则易产生不良反应和依赖性[4]。中医药则通过辨病、辨证、辨体结合的诊疗模式，以较好的临床疗效与安全性，为本病改善症状、预防复发提供了有益的参考[5]。

二妙散由苍术、黄柏组成，首载于元代旴江医家危亦林所著的《世医得效方》，原方名为苍术散，后朱丹溪称之为二妙散。其中，苍术辛烈温燥，可升可降，长于祛风胜湿；黄柏苦寒沉降，善清下焦湿热。二药合用，一温一寒，并走于下，主治湿热流注之筋骨疼痛、下部湿疮、脚气赤肿等。苍术、黄柏配伍精良，方简效宏，是古今众多医家治疗湿热类疾病的核心药组，被广泛运用于临床各科。姚高升[6]以二妙散为基础方随证加减治疗湿疹，收效显著。王振刚等[7]运用二妙散加味治疗阴囊湿疹165例，总有效率达97.54%。可见，二妙散治疗湿疹效果确切，但多集中于临床研究，相关药效成分及其作用机制尚需进一步阐明[8]。

网络药理学是大数据时代背景下系统生物学、多向药理学、计算机软件等相融合的新兴学科，其通过可视化技术、组学方法等展示疾病-靶点-药物的多层次网络，尤其适合揭示中药及复方的多成分、多靶点、多途径协同作用的机理[9]。本文采用生物信息学分析方法，结合分子对接技术[10]，以二妙散入血活性成分为研究对象，分析其治疗湿疹的作用靶点与信号通路，进一步阐释其临床应用的科学内涵，为后续实验及新药研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 二妙散药物活性成分及相关靶点的筛选通过TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/）收集并筛选二妙散中苍术和黄柏的有效成分，设定口服生物利用度（OB）≥30%与类药性（DL）≥0.18的2个药物代谢动力学（ADME）属性值为筛选条件，获取有效入血成分及其对应的作用靶点，并利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点的蛋白名统一转换为基因名。

1.2 湿疹相关靶点的获取及共同靶点的Venny分析以“eczema”为关键词，在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）和Disgenet数据库（https://www.disgenet.org/）检索湿疹相关靶点，运用Excel去除重复靶基因。将药物和疾病靶点上传至Venny作图平台（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html），得到疾病与药物的共同靶点，即二妙散治疗湿疹的潜在作用靶点。

1.3 二妙散“中药-化合物-靶点-湿疹”调控网络的构建及拓扑分析将1.2所得的潜在作用靶点在EXCEL中进行反向筛选，获得相应的活性化合物，采用Cytoscape 3.7.1软件构建二妙散“中药-化合物-靶点-湿疹”网络，并运用Cytoscape 3.7.1进行有效成分的网络拓扑参数分析，以度（Degree）值为标准筛选出重要的成分，Degree值越大，则该节点在网络中就越重要。

1.4 二妙散成分-湿疹靶点PPI网络构建及拓扑分析将1.2所得的潜在作用靶点导入STRING数据库（https://www.string-db.org/），得到蛋白互作网络图及蛋白质相互作用（PPI）数据，将PPI数据文件导入Cytoscape 3.7.1进行图像优化，并运用其中Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，以Degree值为标准筛选出重要的靶点，Degree值越大，则该节点在网络中就越重要。

1.5 二妙散成分-湿疹功能富集分析和KEGG通路富集分析将1.2所得的潜在作用靶点导入DAVID数据库（https://www.david.ncifcrf.gov/），“Select Identifier”设置为“OFFICIAL GENE SYMBOL”，“Select species”设置为“Homo sapiens”，设定P＜0.05，实现功能富集分析和KEGG通路富集分析。

1.6 分子对接验证为验证筛选出的二妙散治疗湿疹潜在关键靶点的准确性，将1.3所得Degree值前10的核心活性成分与1.4所得的6个度值较高的靶点进行分子对接。在TCMSP数据库下载活性成分的3D分子结构，从PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载靶点蛋白结构。采用PyMOL、Autoduck软件对活性成分与靶点蛋白进行脱水（输出pdb格式）、预处理（输出pdbqt格式），最后进行分子对接，对接的最低标准为结合能≤-5.0 kJ/mol。对接完成后，将对接结果用热图展示，对接图像运用Pymol、Discovery Studio 2016软件进行输出优化。

2 结果

2.1 二妙散的活性成分及其靶点TCMSP数据库得到苍术、黄柏的活性成分共189个，筛选后共确定46个，去除无相关靶点的活性成分，最终保留29个活性成分，其中，苍术4个，黄柏25个，见图1、表1。收集活性成分相关作用靶点，其中苍术93个，黄柏287个，去除重复靶点后，二妙散活性成分潜在作用靶点为290个。

图1 二妙散活性成分分布图

表1 TCMSP数据库中保留的药物活性成分信息表

2.2 二妙散治疗湿疹的潜在作用靶点通过Disgenet、Gencards数据库进行湿疹疾病靶点筛选，去除重复靶点，得到相关靶点3481个。运用Venny作图平台获得二妙散活性成分与湿疹共同靶点（潜在作用靶点）141个，见图2。

图2 二妙散治疗湿疹的潜在作用靶点

2.3 二妙散“中药-化合物-靶点-湿疹”网络构建将数据导入Cytoscape 3.7.1构建二妙散“中药-化合物-靶点-湿疹”可视化网络，见图3。通过Cytoscape 3.7.1内置Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，得到度值前10的核心作用成分，见表2。结果显示：主要的活性成分为槲皮素（MOL000098）、汉黄芩素（MOL000173）等。由图3可知，二妙散存在一个化合物作用于多个靶点及不同化合物作用于一个靶点的情况，可见二妙散可通过多种有效成分作用于多个靶基因治疗湿疹。

图3 二妙散“中药-化合物-靶点-湿疹”网络图

表2 二妙散治疗湿疹核心成分信息表

2.4 二妙散治疗湿疹潜在作用靶点PPI网络构建将二妙散治疗湿疹的潜在作用靶点上传至STRING数据库，得到PPI网络及相关信息，并将PPI信息文件导入Cytoscape 3.7.1，得到PPI网络图（见图4），通过Network Analysis分析有效成分的网络拓扑参数，发现INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53等节点度值较高，提示这些靶基因在PPI网络中较重要，其可能是二妙散发挥治疗作用的关键靶点。

图4 二妙散与湿疹共同基因蛋白互作网络图

2.5 富集分析通过DAVID数据库对二妙散治疗湿疹的潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，均保留P＜0.05的结果，得到GO条目651条，包括：药物应答（response to drug）、细胞对脂多糖的反应（cellular response to lipopolysaccharide）等生物过程（BP）条目507条；细胞外空间（extracellular space）、质膜的组成部分（integral component of plasma membrane）等细胞组成（CC）条目49条；药物结合（drug binding）、酶结合（enzyme binding）等分子功能（MF）条目95条。对较重要条目运用Origin 2018绘制柱状图进行可视化，见图5。

图5 二妙散GO功能富集分析图

KEGG通路富集分析显示，湿疹可能与TNF信号通路（TNF signaling pathway）、利什曼病信号通路（Leishmaniasis）、癌症信号通路（Pathways in cancer），Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等120条通路有关。对前20条通路运用Origin 2018进行可视化，见图6。其中，横坐标为通路名称（Term）；纵坐标为Gene Ratio值，表示富集在信号通路上的靶点占该通路靶点数的比例；气泡大小表示富集靶点数目（Count）；气泡颜色用于表示LgP，LgP越小，代表富集程度越显著。

图6 二妙散KEGG通路富集分析图

2.6 分子对接验证为明确靶点蛋白与所对应的成分之间的结合活性，本研究选取度值前10的核心活性成分作为配体，以INS、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53共6个度值较高的基因作为受体，进行分子对接验证。配体具有的潜在作用活性越强，与受体结合能量越低，对接打分则越高。分子对接所得结果显示Docking Score均大于5，且形成范德华力、氢键、Pi-Sigma作用等，提示核心活性成分与靶点均具有较好的结合活性，分子对接结果见图7，部分分子对接见图8。

图7 二妙散核心活性成分与关键靶点的分子对接打分热图

图8 二妙散中活性成分与关键靶点的部分分子对接图（左侧为3D，右侧为2D）

3 讨论

湿疹是一种由内外多种因素引起的过敏性皮肤病，病因尚未明确，且发病机制复杂，导致其治疗缺乏针对性和特异性。研究[11-12]表明，湿疹的发病主要与遗传、免疫紊乱、内分泌失调及外界不良刺激等诸多因素有关。其中，由T淋巴细胞介导的细胞免疫在本病的发展中起到了重要作用，其通过分泌IL-6、IL-10等细胞因子，并与各种炎症细胞共同作用，引起皮肤血管壁通透性增加、血管扩张而形成湿疹样病变[13]。

中医学认为，湿疹可缘于腠理不密，外感毒邪，虽发于表，但亦与内在脏腑功能失调有关，尤其与心火、脾湿关系甚为密切[14]。对本病的治疗，历代医家重视从风、湿、热论治。据报道，在治疗湿疹的常用药物中，清热药与利水渗湿药占比最高，其中苍术与黄柏均为使用频率排名前十的中药[15]。相关研究显示，苍术具有显著的抗炎作用，可抑制TNF、IL-6、IL-8等炎性细胞因子，调节肥大细胞介导的炎症反应，并且其化合物还具有多种抗菌活性[16-19]；黄柏可通过降低毛细血管通透性，有效缓解湿疹炎症的渗出度，其有效成分小檗碱对湿疹的主要致病菌金黄色葡萄球菌还具有较强的抑制作用[20-21]。

网络药理学结果显示，槲皮素、汉黄芩素、豆甾醇等29个成分为治疗湿疹的潜在活性成分。其中，槲皮素已被证实能够抑制组胺的释放，有助于缓解皮肤病的过敏性炎症[22]。研究[23]表明，汉黄芩素可通过诱导嗜酸性粒细胞凋亡，从而有效降低其数量，具有治疗过敏性炎症的作用。根据PPI分析，结合“中药-化合物-靶点-湿疹”网络发现AKT1、IL6、TNF等为关键靶点。AKT1是表皮末端分化的重要信号分子，可影响角质层的脆性及屏障功能，其活性的降低会引起角质形成细胞分化样改变，导致湿疹皮炎中的角化不全[24]。研究表明，金黄色葡萄球菌感染是湿疹发病的重要原因，同时还可加重病情，在相关动物模型中IL6等促炎性细胞因子水平显著升高[25]。TNF细胞因子的部分家族成员及其受体的表达水平与湿疹病变呈正相关，具有潜在的致病性[26]。KEGG通路富集分析发现，二妙散调治湿疹主要涉及TNF信号通路、利什曼病信号通路、癌症信号通路、Toll样受体信号通路等。利什曼病是由利什曼原虫感染所致，其可通过在细胞内诱导迟发型超敏性肉芽肿反应，加重局部组织损伤，从而引发皮肤或皮肤黏膜疾病[27]。湿疹的发病还与Toll样受体的多态性有关，其可通过细菌定植或阻碍Th1反应/Th2转移，诱发变态反应性疾病[28]。分子对接结果表明，槲皮素、谷甾醇、豆甾醇等活性成分与靶蛋白AKT1、IL6、TNF具有良好的对接活性，提示二妙散活性成分与靶蛋白结合稳定，以此发挥治疗湿疹的作用。

旴江医学，名方璀璨，其中二妙散以其药简效宏著称，后世多有依此化裁者，流传古今，具有较强的生命力。本文通过网络药理学和分子对接技术初步分析了二妙散治疗湿疹的活性成分、潜在作用靶点及生物学过程等，得出TNF信号通路、利什曼病信号通路、癌症信号通路、Toll样受体信号通路等可能是其治疗湿疹的主要途径。综上，本研究可为旴江古方科学内涵的现代化诠释提供参考借鉴。