miR-346缓解心肌缺血再灌注大鼠心肌氧化应激损伤

刘雨露, 朱子贵, 张建新, 赵 红, 姚平波

缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是指组织器官缺血一定时间后恢复血流灌注时，缺血组织损伤加重的现象，多发于冠状动脉旁路移植术、溶栓治疗、心脏直视手术等血流供应恢复过程中[1]。目前，I/R损伤主要采用抗氧化、抗炎、钙通道阻滞剂、血管活性药物等治疗，尚缺乏治疗的特效药物[2]。miR-346属于miRNA家族，在心血管疾病、恶性肿瘤等多种疾病中均出现差异表达[3-4]。近年来研究显示，miR-346可以调控凋亡相关基因的表达，调节心肌I/R损伤参与心肌I/R损伤大鼠的心肌细胞凋亡[5]，但相关研究报道较少，且其对心脏功能的影响及作用的具体方式尚不明确。该研究分析了miR-346过表达对I/R大鼠氧化应激和心肌组织细胞凋亡的作用，旨在为临床新药研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂与仪器miR-346 ago和阴性对照miR-NC重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，RVVA)由上海汉恒生物技术有限公司设计和合成；肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、肌红蛋白(myoglobin，Mb)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、超氧化物歧化酶(superoxde dismutase，SOD)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒，均购自南京森贝伽生物科技有限公司；TUNEL组织细胞凋亡检测试剂盒，购自深圳市拓普生物科技有限公司；兔抗鼠B细胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia，Bcl)-2基因、Bcl相关蛋白(Bcl-associate X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3，Cas-3)、cleaved Cas-3、Cas-9、cleaved Cas-9、β-actin单克隆抗体和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗均购于美国CST公司；BX60型光学显微镜购自日本OLYMPUS公司；Vivid 7.0彩色超声仪购自美国GE公司；FPMOUS-ECGenie小动物心电图监测仪购自孚光精仪(中国)有限公司；RT-PCR仪(IQTM5型)购自美国Bio-Rad公司；AlphaImager HP凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司。

1.2 实验动物SPF级SD雄性大鼠48只，6～8周龄，体质量为260～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2017-0022，饲养于南华大学动物中心实验室，许可证号：SYXK(湘) 2020-0002。研究经动物实验伦理委员会审核批准，动物实验伦理批号为NHDXFSNHYY20200603。

1.3 动物分组与miR-346过表达48只大鼠预饲养7 d后，采用简单随机分组将其随机分为对照组、I/R组、I/R+agomiR-NC组和I/R+agomiR-346组，12只/组。I/R+agomiR-NC组经尾静脉注射RAAV-miR-NC，I/R+agomiR-346组经尾静脉注射RAAV-miR-346，1次/d，连续注射2周。对照组和I/R组经尾静脉注射等体积0.9%NaCl溶液，连续注射2周。

1.4 动物造模末次干预后，除对照组外所有大鼠均采用参考已有文献复制心肌I/R模型[6]，常规麻醉，结扎左冠状动脉前降支，缺血30 min后，恢复血流灌注120 min。对照组只插入线栓，不结扎。

1.5 心功能检测和标本采集再灌注120 min后，使用小动物心电图监测仪检测大鼠心率(heart rate，HR)，彩色超声仪检测大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短轴缩短率(fractional shortening，FS)和左心室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)。检测后，常规麻醉，分离腹主动脉血液，离心(3 000 r/min，10 min)，取血清，暂存于-20 ℃冰箱保存，分离心脏，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分暂存于-80 ℃冰箱保存。

1.6 RT-PCR检测心肌组织miR-346水平取暂存于-80 ℃冰箱的心肌组织，匀浆后，根据试剂盒操作说明，依次进行总RNA提取，确定RNA纯度和浓度，反转录合成cDNA，上机进行RT-PCR反应。miR-346上游引物为5′-GAGTGCCTGCCTCTCTGTTG-3′，下游引物为5′-GAGCAGCTCTGCCCAGG-3′，以U6为内参，采用2-ΔΔCt法检测各基因的相对表达量。

1.7 HE染色检测心肌组织损伤取甲醛固定的大鼠心肌组织，进行常规的切片制作和HE染色，另一份进行TUNEL染色，严格按照试剂盒说明操作，光镜下观察心肌组织病理变化，参考已有文献[5]评估心肌组织病理积分。

1.8 血清和心肌组织中相关因子的测定免疫标记法检测血清CK-MB、Mb、LDH、cTnI水平，ELISA法检测心肌组织SOD、GSH-Px和MDA水平，严格按试剂盒说明书进行测定。

1.9 TUNEL检测心肌组织细胞凋亡取甲醛固定的大鼠心肌组织，严格按照试剂盒说明进行切片制作和TUNEL染色，光镜下观察心肌组织细胞凋亡。

1.10 Western blot检测心肌组织Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表达取暂存于-80 ℃冰箱的心肌组织，匀浆后，提取总蛋白，进行凝胶电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加一抗(Bax、Bcl-2、Cas-3和Cas-9，稀释比例均为1 ∶500)，4 ℃孵育过夜，加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，显影，以β-actin为内参分析对比条带强弱。

2 结果

2.1 各组I/R大鼠心肌组织miR-346水平I/R+agomiR-346组大鼠心肌组织miR-346水平高于I/R+agomiR-NC组(q值=13.352，P<0.05)，I/R组心肌组织miR-346水平低于对照组(q值=15.796，P<0.05)，I/R+agomiR-NC组与I/R组心肌组织miR-346水平差异无统计学意义。见图1。

图1 各组I/R大鼠心肌组织miR-346水平A：对照组；B：I/R组；C：I/R+agomiR-NC组；D：I/R+agomiR-346组；与对照组比较：*P<0.05；与I/R+agomiR-NC组比较：#P<0.05

2.2 miR-346过表达对I/R大鼠心功能的影响I/R+agomiR-346组大鼠HR、LVEF、FS和LVWT高于I/R+agomiR-NC组(P<0.05)，I/R组大鼠HR、LVEF、FS和LVWT低于对照组(P<0.05)，I/R+agomiR-NC组与I/R组大鼠HR、LVEF、FS和LVWT差异无统计学意义。见表1。

表1 各组I/R大鼠心功能

2.3 miR-346过表达对I/R大鼠心肌组织损伤的影响对照组I/R大鼠HE染色显示心肌组织细胞未见异常；I/R组和I/R+agomiR-NC组显示心肌纤维断裂，细胞出现变性、坏死，且伴随大量炎性细胞浸润；I/R+agomiR-346组显示心肌组织细胞病理变化减轻。见图2。

图2 各组I/R大鼠心肌组织病理变化 HE×200A：对照组；B：I/R组；C：I/R+agomiR-NC组；D：I/R+agomiR-346组

2.4 miR-346过表达对I/R大鼠心肌组织损伤标志物的影响I/R+agomiR-346组大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平低于I/R+agomiR-NC组(P<0.05)，I/R组血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平高于对照组(P<0.05)，I/R+agomiR-NC组与I/R组大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平差异无统计学意义。见表2。

表2 各组I/R大鼠心肌组织损伤标志物水平

2.5 miR-346过表达对I/R大鼠氧化应激的影响I/R+agomiR-346组大鼠心肌组织MDA水平低于I/R+agomiR-NC组，SOD和GSH-px水平高于I/R+agomiR-NC组(P<0.05)；I/R组心肌组织MDA水平高于I/R+agomiR-NC组，SOD和GSH-px水平低于I/R+agomiR-NC组(P<0.05)；I/R+agomiR-NC组与I/R组心肌组织MDA、SOD和GSH-px水平差异无统计学意义。见表3。

表3 各组I/R大鼠氧化应激水平

2.6 miR-346过表达对I/R大鼠心肌组织细胞凋亡的影响I/R+agomiR-346组大鼠心肌组织细胞凋亡率低于I/R+agomiR-NC组[ (18.22±3.76)%vs(27.93±5.48)%，q=7.858，P<0.05]，I/R组大鼠心肌组织细胞凋亡率高于对照组[(28.33±5.21)%vs(7.22±1.41)%，q=17.083，P<0.05]，I/R+agomiR-NC组与I/R组心肌组织细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 各组I/R大鼠心肌组织细胞凋亡 TUNEL×200A：对照组；B：I/R组；C：I/R+agomiR-NC组；D：I/R+agomiR-346组

2.7 miR-346过表达对I/R大鼠心肌组织Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表达的影响I/R+agomiR-346组大鼠心肌组织Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表达低于I/R+agomiR-NC组(q=21.324、14.596、9.872；P<0.05)，I/R组心肌组织Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表达高于对照组(q值=19.681、13.243、8.570；P<0.05)，I/R+agomiR-NC组与I/R组心肌组织Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表达差异无统计学意义。见图4。

图4 各组I/R大鼠心肌组织Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表达A：对照组；B：I/R组；C：I/R+agomiR-NC组；D：I/R+agomiR-346组；与对照组比较：*P<0.05；与I/R组比较：#P<0.05

3 讨论

I/R损伤是组织缺血后，恢复血流供应时组织损伤加重的病理过程，与缺血低氧刺激生成的大量氧自由基，及其引起的心肌细胞能量代谢障碍、细胞凋亡等有关，严重影响了组织缺血后的恢复；临床尚缺乏治疗其特效药物。miR-346是近年来研究中发现的与多种疾病相关的小RNA，可以靶向调节凋亡蛋白Bax表达，抑制心肌细胞凋亡。该研究探讨了miR-346在心肌I/R大鼠中的表达和作用，结果显示I/R大鼠心肌组织中miR-346表达较对照组降低，说明miR-346可能参与I/R损伤的病理过程。该研究中，I/R大鼠的HR、LVEF、FS和LVWT较对照组下降，miR-346过表达后，HR、LVEF、FS和LVWT升高，表明miR-346过表达可以改善I/R大鼠的心功能。该研究表明，I/R大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平相较于对照组升高，且心肌组织表现出病理变化，而miR-346过表达后，血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平下降，心肌组织病理变化减轻。CK-MB、LDH、Mb、cTnI均为临床较为常用的指标，广泛存在于心肌组织细胞中，在细胞受损时可以释放进入血清，其在血清中的水平变化可以反映心肌细胞损伤。研究结果表明，miR-346过表达可以减轻心肌I/R大鼠的心肌组织损伤，改善心功能，有望成为I/R治疗的新靶点。

该研究表明，I/R大鼠的心肌组织MDA水平较对照组升高，SOD和GSH-px较对照组下降，而miR-346过表达后，MDA下降，SOD和GSH-px升高。SOD是生物体内最主要的抗氧化酶之一，广泛分布于心肌细胞质内，可以通过氧化还原反应，抑制多种过氧化物的作用，清除体内过多的活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)并将其转化为其它物质[7]。GSH-px是广泛分布于心肌组织细胞的过氧化物分解酶，可以抑制ROS产生，降低心肌细胞内的氧化应激水平[8]。MDA是ROS代谢过程中产生的中间产物，是临床常用的反映心肌细胞氧化应激水平的指标[9]。既往多项研究[10-11]显示，I/R过程中产生的大量ROS是导致心肌组织细胞死亡，导致I/R损伤的主要因素。上述研究表明miR-346过表达可能通过抗氧化作用，清除过量的ROS，减轻I/R大鼠的心肌组织损伤。

该研究表明，I/R大鼠的心肌组织Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表达较对照组升高，细胞凋亡率升高，而miR-346过表达后，Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表达下降，细胞凋亡率下降。Bcl-2/Bax是一组可以调控细胞凋亡的蛋白，生理状态下，Bcl-2定位于线粒体膜表面，Bax主要位于胞质中，在凋亡信号作用下，Bax可以与Bcl-2相结合，在线粒体膜上形成孔道，破坏膜完整性，使线粒体释放细胞色素C入胞质，激活Caspase凋亡级联反应[12]。Caspase家族是调控内源性细胞凋亡的蛋白酶系统，其中cleaved Cas-9为始动因子，cleaved Cas-3为凋亡效应因子，胞浆中的细胞色素C可以与相应的蛋白结合，激活Cas-9，从而激活Cas-3，启动细胞凋亡程序，降解多种重要蛋白，导致细胞裂解死亡[13]。该研究结果表明，miR-346过表达可以抑制线粒体凋亡途径，抑制I/R大鼠心肌细胞凋亡，减轻心肌组织损伤。既往研究[14]显示，I/R过程中产生的大量ROS可以激活线粒体凋亡途径，诱导心肌组织细胞死亡，导致I/R损伤。该研究结果表明，miR-346过表达可能通过抗氧化作用，抑制心肌细胞凋亡，降低I/R大鼠的心肌组织损伤。