新疆地区3 个规模化奶牛场乳房炎致病菌的分离鉴定与药敏试验

陈 杰，魏 勇，王晨豫，曹梦园，解津刚，齐亚银＊

1 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000

2 新疆天澳牧业有限公司，新疆奎屯 833200

关键字：乳房炎；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛乳腺发生的一种炎症反应，是由病原微生物感染、环境因素、饲养管理因素、奶牛自身及遗传因素等综合因素作用引起的一种疾病，也是奶牛场最常见的疾病之一[1，2]，对奶牛场危害极大。奶牛乳房炎致病菌以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，由这三种病原菌引起的乳房炎发病率在90%以上[3]。根据炎症的严重程度，奶牛乳房炎大体上可以分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。临床型乳房炎，在视觉上可见明显的受感染表征，如乳汁的异常，包括颜色改变，存在凝块或呈片状；乳腺发生异常，包括乳腺表面组织颜色改变，呈现肿胀形态；奶牛状态的异常，包括体温、食欲及饮水量[4]。而隐性乳房炎，虽然在临床体征上没有明显的变化，很难及时诊断，但对奶牛的奶产量和乳质量均带来了严重的影响[5]。在一个牛群中，隐性乳房炎的发病率约为90%[6]。

本研究从新疆地区3 个规模化奶牛场中采集乳房炎奶牛的生鲜乳，通过分离鉴定样品中的致病菌，对其进行药敏试验，为新疆地区奶牛乳房炎致病菌流行情况提供参考，同时为新疆地区奶牛乳房炎的临床治疗和预防提供合理的用药指导。

1 试验材料

1.1 主要试剂及药品

LB肉汤培养基（上海生工生物工程股份有限公司），麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基、革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司），2×Taq Plus Master mix Ⅱ（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），DNA Marker Ⅰ、2K DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司），SuperRed核酸染液（合肥兰杰柯科技有限公司），细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），引物（北京睿博兴科生物技术有限公司），药敏试纸（杭州滨和微生物试剂有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

光学显微镜（Olympus公司），高压灭菌器（Hirayama公司），电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），旋涡混合器（Scientific Industries公司），电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），恒温培养箱（北京市永光明医疗仪器厂），超净工作台（上海鸿都电子科技有限公司），离心机（Sigma公司），隔水式恒温培养箱、电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂）、全自动振荡培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司），PCR扩增仪（Techne公司），电泳仪（北京市六一仪器厂），凝胶成像仪（Biorad公司），微量移液器及大容量移液枪（英国Bibby科技有限公司），牛博士Ⅲ型体细胞检测仪器[华诚睿光（中国）生物科技有限公司]。

2 试验方法

2.1 样品采集

2021年8—9月，在新疆地区选择存栏1 100~1 400头的3 个规模化奶牛场，并根据奶牛的DHI数据，筛选出体细胞数≥500 万个/mL的临床型乳房炎奶牛进行奶样采集（所选牛只均未投喂含有抗生素的饲草料，并且未经过兽医治疗）；再使用牛博士体细胞检测仪，对临床型乳房炎奶样进行二次确诊。其中A牧场、B牧场、C牧场符合条件的奶样分别为79 份、81 份和83 份，总共243份。

2.2 乳房炎致病菌的分离纯化

将奶样充分涡旋振荡均匀，移取50 μL，转种于800 μL的LB肉汤培养基内，在37 ℃，180 r/min条件的振荡培养箱中培养18~24 h后，划线接种于麦康凯琼脂培养基上，在37 ℃的恒温培养箱中培养18~24 h后，挑取玫红色单个菌落转种于LB肉汤培养基中，振荡培养18~24 h后，将增菌液再次在伊红美兰琼脂培养基上划线接种，在37 ℃的恒温培养箱中培养18~24 h后，挑取紫黑色带金属光泽的单菌落进行涂片，革兰氏染色，显微镜下镜检，将呈中等大小的革兰氏阴性杆菌的单菌落再次转种于LB肉汤培养基，振荡培养18~24 h。

2.3 分离菌形态学观察

使用接种环分别将纯化后的菌液均匀涂抹在载玻片中央，将载玻片置于酒精灯外焰3~5 cm处固定，经革兰氏染色法染色后，在100 倍油镜下观察菌株形态。

2.4 分离菌株的PCR鉴定

依照DNA提取试剂盒操作步骤提取分离细菌的DNA，并对提取的细菌DNA进行PCR扩增，引物合成参考相关文献[7]，引物序列及条件见表1，反应体系为25 μL：2×Taq Plus Master mix Ⅱ12.5 μL，双蒸水8.5 μL，上下游引物各1 μL，细菌DNA模板2 μL。反应程序为：大肠杆菌：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。扩增PCR产物片段小于700 bp的使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为1×TAE电泳液，120 V，90 mA，40 min。用凝胶成像仪对电泳后的琼脂糖凝胶进行分析。

表1 PCR扩增条件及引物序列

2.5 分离菌株的药物敏感性试验

主要药敏试纸选择为：头孢噻肟、青霉素、万古霉素、链霉素、庆大霉素、诺氟沙星、丁胺卡那霉素、氨苄西林、四环素、阿莫西林、环丙沙星等。将分离纯化后的大肠杆菌，接种于LB肉汤培养基中，置于恒温摇床内增菌培养24 h后，用生理盐水将菌液浓度调节至（1~2）×10 CFU/mL。按照纸片法的操作，吸取适量菌液涂布在琼脂平板上，取出不同药敏纸片，贴于琼脂表面，不同药敏纸片的间距≥24 mm。将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，测量琼脂上的抑菌环直径。评判结果参照美国临床实验室国家标准化管理委员会标准（CLSI2008）。

3 结果与分析

3.1 分离菌株的初步鉴定及形态学特征

纯化后的菌液划线于麦康凯琼脂培养基上的形态为玫红色、边缘光滑、湿润的菌落；伊红美兰琼脂培养基上的形态为紫黑色带金属光泽的菌落；经革兰氏染色后，在显微镜下呈现中等大小的革兰氏阴性杆菌（图1）。

图1 大肠杆菌的菌落特征和形态结构

3.2 PCR 鉴定结果

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，产物大小与预期一致，为264 bp（图2）；3 个规模化奶牛场所采集的243 份奶样经PCR鉴定为大肠杆菌的共有187 株，其中A场66 株、B场62 株、C场59 株。

图2 部分大肠杆菌PCR结果

3.3 药敏试验检测结果

由表3可知，大肠杆菌对头孢噻肟、链霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、环丙沙星高度敏感。

表3 不同药物对大肠杆菌的平均抑菌直径

4 讨论

奶牛乳房炎的发生可对奶牛产奶量和乳品质造成严重影响[8]。大肠杆菌被认为是引起国内奶牛乳房炎的第二大病原菌，仅次于金黄色葡萄球菌[9]。大肠杆菌广泛存在于自然环境中，如圈舍的垫料、奶牛的粪便等[10]。由于奶牛场管理不善，圈舍环境不良而导致的大肠杆菌性奶牛乳房炎的发病率相对较高，多发于泌乳高峰期和高产奶牛，并且发病无明显的季节性[11]，常呈现急性经过[12]。当奶牛场出现乳房炎时，会造成一系列负面效应，如牛奶品质下降、奶牛淘汰率升高、治疗用药成本增加、牛奶中药物残留增多等，极大地降低了奶牛场的经济效益[13]。研究表明，控制大肠杆菌性乳房炎，可有效提高奶牛产奶量[14]。因此对奶牛乳房炎的主要致病菌进行分离鉴定，提供合理的预防、治疗方案相当重要。