抑霉唑手性异构体及其代谢物在柑橘贮藏中的选择性行为

姚周麟, 章 虎, 吴韶辉, 林 媚, 王 强, 李祖光

(1. 浙江工业大学，杭州 310014；2. 浙江省农业科学院，杭州 310021)

手性农药是新兴且重要的一类农用化学品[1-2]，通常含有一个或多个不对称中心，大多手性农药是合成产物[3]。在手性农药中，以手性杀螨剂、杀线虫剂和杀虫剂较多，约占40.5%，其次是手性杀菌剂和手性除草剂[4]。手性农药在生物体和环境中的降解和积累具有立体选择性，其中某种异构体可能对人类健康和环境安全产生影响[5]，尤其是与其他手性分子 (如酶和生物受体[6]) 相互作用时，不同手性异构体的生物有效性、毒性、环境性质可能存在显著差异[7-8]，如一个对映体易在环境中积累，而另一个对映体易发生降解[9]，对映体间的降解动力学参数也会不同[10]。为此，亟需从手性对映体水平建立农药残留的分析方法，研究其在环境中的选择性行为。

柑橘是中国重要的进出口商品之一[11]，柑橘类水果在田间及采后极易受到微生物侵染而产生病害，最终导致果实腐烂，在中国由此造成的柑橘损失率高达20%～25%[12]。柑橘采后的主要病害为青霉病和绿霉病[13]，而传统杀菌剂抑霉唑(imazalil) 可有效防治这两种病害，降低腐烂率[14]。然而，杀菌剂不正当使用可能导致柑橘及其加工产品中存在杀菌剂残留超标的问题，对人类健康和环境造成潜在危害。因此，很多国家均对柑橘上的杀菌剂残留提出了相关限量要求，例如，中国和日本规定柑橘中抑霉唑的最大残留限量 (MRL)均为5 mg/kg[15-16]。

抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇均为手性分子(图式1)，各存在一对对映异构体。由于生产和纯化过程成本较高，因此包括抑霉唑在内的大多数手性农药仍以外消旋混合物的形式出售和使用[5]。手性农药不仅对靶标生物的作用可能存在不同，其在环境积累、细胞毒性、内分泌干扰及致癌性方面也存在差异。有研究表明：S-(+)-己唑醇对蚯蚓的急性毒性高于R-(−)-己唑醇，48 h 的LC50值分别为8.62 和22.35 μg/cm2[17]；丙溴磷对映体在柑橘中的降解存在明显的选择性，(+)-丙溴磷和 (−)-丙溴磷的降解半衰期分别为 12.53 d 和14.14 d[18]；S-(−)-抑霉唑比R-(+)-抑霉唑具有更快的降解速率、更高生物活性和生态毒性[19]。

图式 1 抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇的结构式Scheme 1 The structural formulas of imazalil and its metabolite imidazole ethanol

研究手性杀菌剂在采后柑橘中的选择性降解规律可为柑橘中农药残留的质量安全评价提供技术支撑。常见杀菌剂肟菌酯、噻菌灵、嘧菌酯和嘧霉胺在柑橘贮藏期间的降解行为研究已有分析报道，这些与贮藏温湿度、施药剂量相关的残留数据是柑橘质量安全控制的重要参考信息[20-21]；而抑霉唑在柑橘贮藏过程中的选择性降解变化及其代谢产物的积累情况尚未见系统报道。鉴于此，本研究采用超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)技术，建立抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇的手性分离分析技术，阐述其在柑橘保鲜中的立体选择性残留规律及其代谢产物积累情况，以完善柑橘中农药残留的安全评价信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料、试剂和仪器

供试柑橘品种为椪柑Citrus reticulataBlanco cv. Ponkan，由浙江省柑橘研究所 (浙江，台州) 提供，树龄30 a，砧木为枸头橙，于果实成熟期(2020 年12 月9 日) 随机采样，要求果实大小相近，无病虫害、无损伤。

抑霉唑 (imazalil，纯度99.7%) 及其代谢产物咪唑乙醇 (imidazole ethanol，纯度99.5%)标准品，均购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。将供试化合物溶于甲醇 (色谱级)，配制成质量浓度为100 mg/L 的标准溶液，用棕色瓶于 −20 ℃下保存。抑霉唑对映体peak 1 和peak 2，咪唑乙醇对映体peak 1 和peak 2 均由上海勤路公司提供。贮藏试验采用市售的22.2%抑霉唑乳油 (神越，山东东合生物科技)。

ExionLC AD System (UPLC)+AB Triple Quad-5500+超高效液相色谱-串联质谱检测仪 (美国AB SCIEX 公司)。手性色谱柱分别为Lux Cellulose-2(150 mm × 2 mm，粒径3 μm，美国Phenomenex公司)；固定相为纤维素-三 (3-氯-4-甲基-苯基-氨基甲酸酯)；Chiralpak IG-3 (150 mm × 2.1 mm，粒径3 μm，大赛璐药物手性技术有限公司)，固定相为直链淀粉-三 (3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯)。具有可调节波长功能的Jasco J-815 圆二色光谱仪 (日本Jasco 公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理 称取均质后的柑橘 (果肉或全果15g、果皮5g) ，加入 15 mL 乙腈 (含体积分数为1%的乙酸)涡旋1 min，超声15 min。快速加入6 g 无水硫酸镁和1.5 g 无水醋酸钠，振摇5 min，于8000 r/min 下离心3 min；将上清有机相转移至空离心管中，加入50 mg PSA、50 mg C18和150 mg 无水硫酸镁，充分涡旋混合；上清液过0.22 μm 有机滤膜后待分析。

1.2.2 绝对构型确定 手性化合物的对映体通常通过其绝对构型或特定的圆二色性 (CD) 信号来区分。本研究中，在圆二色光谱仪上进行ECD(电子圆二色谱，Electronic circular dichroism) 测定，光谱扫描范围为210～300 nm，用ComputeVOA 得出对映体构型的计算谱图，在计算中需考虑溶剂的影响。

1.2.3 色谱与质谱检测条件 色谱条件：对于抑霉唑对映体，采用Lux Cellulose-2 手性色谱柱，流动相为V(乙腈) :V(水) = 70 : 30，流速0.3 mL/min，进样量2 μL。对于咪唑乙醇对映体，采用Chiralpak IG-3 手性色谱柱，流动相为V(甲醇) :V(水)=90 :10，流速0.6 mL/min，进样量2 μL。

质谱条件：采用多反应监测扫描 (MRM) 模式，电喷雾离子源ESI(+)，毛细管温度350 ℃，喷雾电压4500 V。锥孔气体 (N2) 流速40 mL/min；碰撞气体 (Ar) 流速0.15 mL/min。脱溶剂气体(N2)流速12 mL/min，温度500 ℃。质谱参数见表1。

表1 抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of imazalil and its metabolite imidazole ethanol

1.2.4 标准曲线 将100 mg/L 的储备液用甲醇逐级稀释至外消旋质量浓度分别为0.001、0.005、0.01、0.025、0.10、0.25、0.50 和1.0 mg/L 的溶剂标准溶液，用于测定抑霉唑和咪唑乙醇各对映体的溶剂标准曲线；同时采用柑橘基质 (全果、果肉和果皮) 配制抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇各对映体的基质标准曲线。

1.2.5 基质效应 基质效应 (matrix effect,Me) 会影响目标化合物的定量分析结果，本研究通过参数Me评价抑霉唑及咪唑乙醇在不同柑橘基质中的基质效应，按 (1) 式计算。

式中：km为基质标准曲线斜率，ks为溶剂标准曲线斜率。

当Me>10%时，表明存在明显的基质增强效应；当Me< −10%时，表明存在明显的基质抑制效应；−10%≤Me≤10%时，表明基质效应不显著[22]。

1.2.6 方法的准确度与精密度 在空白柑橘基质(橘皮、橘肉和全果) 中添加不同水平的抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇对映体，测定各添加水平下的回收率。4 个对映体的添加水平分别为0.0005、0.05、0.125、0.25 mg/kg，每个水平重复5 次。分别添加到3 种基质中，混匀后静置1 h。前处理方法同1.2.1 节。

1.3 抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘贮藏中的选择性行为研究

1.3.1 贮藏试验场地 供试柑橘采集自浙江省柑橘研究所试验园 (台州市黄岩区)，试验橘树在采收前未喷施任何保鲜剂。贮藏试验在柑橘贮藏仓库内进行，于试验前10 d 进行全面消毒。柑橘浸药后置于塑料贮藏箱中，贮藏箱带孔、内部四周垫有纸张防潮。贮藏箱离地摆放于仓库的货架上。库房内通风透气，利用开关通风窗的自然换气方法来调节室温，各处理贮藏环境条件均一致。

1.3.2 贮藏试验处理和样品采集 将22.2%抑霉唑乳油采用纯净水稀释约150 倍，配制成质量浓度约为1480 mg/L 的水溶液，将新采收的柑橘果实在溶液中浸泡1 min。分别于浸果后0 (2 h)、1、3、5、7、14、21、29、35、45、88、111 和120 d采集柑橘果实 (全果) 10 个，每次取样设3 次重复。采集的样品无需清洗，操作时为避免污染须戴一次性塑料手套。样品前处理采用1.2.1 节方法。

1.3.3 降解动力学参数 根据降解动态变化曲线计算获得降解动力学参数 (公式2)，按公式 (3) 计算半衰期。

1.4 数据分析

文中数据采用Excel 2021 进行统计和分析。

2 结果与分析

2.1 抑霉唑和咪唑乙醇对映体绝对构型的确定及在色谱上的出峰顺序

抑霉唑各对映体实验ECD 图谱 (图1-A) 与通过含时密度泛函理论 (TDDFT，图1-B) 在乙腈溶剂中获得的计算ECD 图谱的积分曲线比较相似。用ComputeVOA 软件进行构象搜索，取相对能量小于0.8 的构象进行进一步的结构优化，根据结构优化后优势构象的热力学数据，计算所有可能构象的玻尔兹曼分布概率，并进行叠加以得出对映体构型的计算ECD 谱图。结构优化采用ub3lyp 泛函/6-31+g(d, p) 基组，根据TDDFT 进行ECD 谱图的计算和拟合，计算过程中考虑到了溶剂乙腈的影响。同时，咪唑乙醇对映异构体在乙腈溶剂中获得的实验ECD 图谱 (图1-C) 和其计算图谱(图1-D) 也非常相似。用ComputeVOA 软件进行构象搜索，取相对能量小于1.5 的构象进行进一步的结构优化和谱图计算，其他参数与抑霉唑相同(计算过程中考虑了溶剂乙腈的影响)。因此可以确定，抑霉唑对映体peak 1 和peak 2 绝对构型分别为S-抑霉唑和R-抑霉唑，咪唑乙醇对映体peak 1和peak 2 绝对构型分别为S-咪唑乙醇和R-咪唑乙醇。

图1 抑霉唑和咪唑乙醇的实验ECD 光谱图(A 和C) 和理论计算ECD 光谱图(B 和D)Fig. 1 Experimental ECD spectra of imidazolium and imidazolium ethanol (A and C) and theoretical calculation of ECD spectra (B and D)

采用本研究的手性拆分方法将上述各已知绝对构型的抑霉唑和咪唑乙醇单一对映体标准品，在手性柱上分别进样，确定各对映体的出峰顺序。如图2 所示：抑霉唑两个对映体在Lux Cellulose-2柱上达到基线分离，出峰顺序为R-抑霉唑和S-抑霉唑，保留时间分别为3.54 和3.80 min；咪唑乙醇两个对映体在手性柱Chiralpak IG-3 的出峰顺序为R-咪唑乙醇和S-咪唑乙醇，基线分离，且保留时间分别为1.08 和1.95 min。

图2 抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇对映体的手性拆分质谱图Fig. 2 Chiral resolution chromatogram of imazalil and its metabolite imidazole ethanol enantiomers

2.2 方法线性关系与基质效应

基质效应是农药残留监测中影响结果准确性的重要因素之一，柑橘中成分复杂，其中的一些非待测组分对目标化合物的质量或浓度准确测定会产生干扰[23]。本研究首先对抑霉唑及咪唑乙醇在甲醇溶剂和不同柑橘基质中的标准曲线进行了分析，结果如表2 所示，溶剂和基质的标准曲线线性关系均较好，其中抑霉唑的R2> 0.9915，咪唑乙醇的R2> 0.9991。在实际样品的数据分析中采用基质校准的标准曲线，可以有效消除基质效应，提高数据的准确度。

表2 抑霉唑和咪唑乙醇对映体的标准曲线和基质效应Table 2 The matrices standard curves and matrix effects of imazalil and imidazole ethanol enantiomers

续表2Table 2 (Continued)

由表2 数据还可以看出，S-咪唑乙醇在柑橘果肉中存在明显的基质增强效应，R-抑霉唑和R-咪唑乙醇在柑橘果肉和全果中也存在明显的基质抑制效应。抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘果实不同部位的基质效应存在差异，如R-和S-抑霉唑在果皮中受到的基质效应显著高于果肉；而R-咪唑乙醇在果肉和全果中的基质效应高达 −33.8%和 −44.2%；S-咪唑乙醇在果肉中的基质效应达29.7%，显著高于全果和果皮。

2.3 方法的基质效应分析

为了分析柑橘基质对抑霉唑和咪唑乙醇检测中的基质效应，采用标准添加法，即分别向溶剂和基质中添加定量的标准溶液，计算基质和溶剂中回收率的差异。结果 (表3) 表明：在4 个添加水平下，抑霉唑对映体在不同基质中的回收率在78%～101%之间，相对标准偏差0.4%～2.9%；咪唑乙醇的回收率在73%～105%之间，相对标准偏差0.4%～5.6%。抑霉唑和咪唑乙醇对映体的LOQ为0.0005 mg/kg。

表3 抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇对映体在柑橘基质中的回收率(n＝5)Table 3 Recoveries of imazalil and its metabolites imidazole ethanol enantiomers in orange matrix (n＝5)

2.4 抑霉唑和咪唑乙醇在柑橘贮藏中的选择性降解行为

2.4.1 抑霉唑对映体在柑橘贮藏中的选择性降解行为 抑霉唑对映体在柑橘贮藏过程的降解动态曲线如图3 所示。可以明显发现，果皮和全果中的R-和S-抑霉唑对映体均随着贮藏时间的增加而逐渐降低。本试验采用新鲜的果实在抑霉唑水溶液中浸果，浸药0 d (2 h) 的果皮中R-和S-抑霉唑在果皮中的残留量高达1.752 和1.579 mg/kg FW，显著高于全果和果肉；此时R-和S-抑霉唑在全果中含量分别为0.516 和0.458 mg/kg FW，而在果肉则仅0.01 和0.009 mg/kg FW，说明全果中的抑霉唑对映体含量主要来自果皮。通过计算抑霉唑降解率可以发现，贮藏45 d 后果皮中S-抑霉唑和R-抑霉唑的降解率分别为42.0%和33.6%，对映异构体间存在显著差异。

图3 抑霉唑对映体在柑橘贮藏中的降解动力学曲线Fig. 3 Degradation curves of imazalil enantiomers in citrus storage

表4 为抑霉唑对映体在柑橘中的降解动态方程，降解符合一级动力学方程，这与常见的农药如多菌灵、甲霜灵和噻菌灵在柑橘基质中的降解动力学情况相同，均符合一级动力学方程[24]。根据回归方程计算结果表明，R-抑霉唑和S-抑霉唑两个对映体在柑橘全果中的降解半衰期分别为136 和158 d，在果皮中的降解半衰期分别77 和82 d，即S-抑霉唑在柑橘全果和果皮中的降解速率明显快于R-抑霉唑，这与Bagnall 等对抑霉唑降解的研究结果一致[19]。

表4 抑霉唑对映体在柑橘果实不同部位中的降解动态方程Table 4 Dynamic equation of degradation of imazalil enantiomers in different parts of orange

图4 为浸药21 d 后抑霉唑及其代谢产物各对映体在柑橘果肉、全果和果皮中残留的质谱图，其中由图4-B 和4-C 均可以明显看出，S-抑霉唑的含量低于R-抑霉唑。随着用药时间的推移，易造成柑橘果实中R-抑霉唑的富集。在贮藏试验中，药剂直接作用于果皮，因此果肉中检测到的R-和S-抑霉唑主要是通过果皮中的抑霉唑内吸积累形成，如贮藏120 d，R-和S-抑霉唑含量仅为0.024 和0.017 mg/kg FW，变化无明显规律。

图4 抑霉唑和及其代谢产物咪唑乙醇各对映体在柑橘实际样品中的谱图(21 d)Fig. 4 Typical spectra of imazalil and its metabolite imidazole ethanol enantiomers in citrus samples (21 d)

手性农药的选择性降解行为会受到环境 (如生物体内的酶、微生物等)的影响，若构成酶结构的蛋白质具有手性特征，会导致手性农药的其中一个对映体优先被降解。例如：在叶面喷施和土壤施药的情况下，(−) 氯啶菌酯A 和 (−) 氯啶菌酯B 在番茄中的降解速率均快于其对映体[25]；S-(+)-苯霜灵在黄瓜中优先降解[26]。此外，同一手性农药在不同作物上的选择性降解行为也存在差异，如 (+)-丙环唑-B 和 (−)-丙环唑-A 在小麦植株上优先降解[27]，然而在葡萄上的降解趋势相反。因此，在不同作物、不同环境下开展手性农药的选择性代谢研究具有重要意义。

2.4.2 咪唑乙醇对映体在柑橘贮藏中的选择性降解行为 抑霉唑代谢产物咪唑乙醇在柑橘果实不同部位的积累动态如图5 所示，果实不同部位的R-咪唑乙醇和S-咪唑乙醇含量均随着浸药时间的推移逐渐增加，由于抑霉唑主要黏附在果皮上，导致果皮上产生的咪唑乙醇残留较高，如120 d 的果皮上R-和S-咪唑乙醇含量可达0.160 和0.440 mg/kg FW，而果肉中R-和S-咪唑乙醇仅为0.017和0.048 mg/kg FW。此外，在整个贮藏过程中，S-咪唑乙醇含量均高于R-咪唑乙醇，如图4 所示，浸药21 d 的柑橘果肉 (图4-D)、全果 (图4-E) 和果皮 (图4-F) 中，S-咪唑乙醇含量均显著高于R-咪唑乙醇，且随着时间的推移，差异更加明显，有选择性积累行为。上述结果说明S-咪唑乙醇在柑橘果实中优先代谢产生，易产生富集现象。

图5 咪唑乙醇对映体在柑橘贮藏中的选择性行为Fig. 5 Selective behavior of imidazole ethanol enantiomers in citrus storage

2.4.3 贮藏期间抑霉唑和咪唑乙醇的EF 变化 贮藏期间柑橘果实不同部位的抑霉唑对映体 EF 值变化趋势如图 6-A 所示，发现全果和果皮中抑霉唑的EF 值随着时间的推移逐渐增加，尤其浸药45 d后增加相对较为明显，此时抑霉唑在全果和果皮中的EF 分别为0.552 和0.560，各储藏时间的EF 值均大于0.5，说明抑霉唑对映体在柑橘中存在选择性降解，R-抑霉唑容易产生富集效果。

图6 贮藏期间抑霉唑 (A) 和咪唑乙醇 (B) 对映体的EF 值变化Fig. 6 Curves of EF value of imazalil (A) and imidazole ethanol (B) enantiomers in citrus storage

随着贮藏时间的推移，抑霉唑代谢产物咪唑乙醇的EF 值也整体呈升高的趋势 (图6-B)，120 d时，全果和果皮的EF 值分别为0.236 和0.267，数值较小，说明在贮藏期间，咪唑乙醇有显著的选择性行为，S-咪唑乙醇积累明显较快。

3 结论

本研究建立了一种基于超高效液相色谱-串联质谱检测柑橘果皮、果肉和全果中抑霉唑和咪唑乙醇对映体的手性拆分方法，利用本方法开展了柑橘(椪柑)贮藏中抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇对映体的选择性降解行为研究。抑霉唑和咪唑乙醇对映体在0.0001～0.5 mg/kg 范围内线性关系良好 (R2>0.9915，>0.9991)，方法定量限 (LOQ) 为0.0005 mg/kg，4 个添加水平 (0.0005、0.05、0.125、0.25 mg/kg) 下抑霉唑和咪唑乙醇对映体在不同基质中的平均回收率分别为78.4%～101.0%和73.0%～104.5%，符合中国NY/T 788—2004《农作物中农药残留试验准则》要求。本方法样品前处理操作简便、溶剂消耗少，分析时间短，具有良好的灵敏度、准确度和精密度，能够满足目前对柑橘果品中抑霉唑对映体残留的检测需要。

由柑橘贮藏试验结果可知，抑霉唑的降解符合一级动力学方程；半衰期和EF 值测定结果表明，S-抑霉唑在柑橘全果和果皮中优先降解，降解速率快于R-抑霉唑；S-咪唑乙醇在柑橘果实各部位的积累速度显著高于R-咪唑乙醇，说明抑霉唑的代谢主要以S-咪唑乙醇的形式在柑橘中累积。根据GB 2763—2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中柑、橘、橙、柠檬、柚的最大残留限量标准为5 mg/kg，本试验数据显示，从柑橘果实浸药开始，果肉和全果中的抑霉唑含量均低于5 mg/kg，未超标。本研究发现，抑霉唑在柑橘中的半衰期较长，建议在生产中使用该化合物防治柑橘青、绿霉病时应注意用药浓度。今后亟需通过结合化学、生物学等技术，深入开展手性抑霉唑降解的影响因子研究，尤其是与人体健康密切相关的手性选择性行为，真实、准确地评价抑霉唑对映体对环境与健康的风险，同时也为抑霉唑等手性农药的正确使用和相关法规的制定提供依据。