淫羊藿苷对大鼠股骨头坏死微血管内皮细胞的影响△

岳聚安，高 贺，张启栋，余华晨，刘 沛，文鹏飞，程立明，郭万首*

（1.航空总医院，北京 1000121；2.中日友好医院关节外科，北京 100029）

股骨头坏死（osteonecrosis of femoral head,ON⁃FH）已经成为一个日益严重的全球性健康问题[1]。目前ONFH的发病机制尚未完全清楚，但人们普遍认为，各种创伤性和非创伤性损伤损害了本已不稳定的股骨头微循环，最终导致骨髓和骨细胞死亡[2，3]。糖皮质激素的使用已成为ONFH最常见的发病原因[2，3]。尽管激素诱导ONFH发病机制尚不完全清楚[4]，但有研究表明，激素诱导股骨头微血管内皮细胞（bone microvascular endothelial cells,BMECs）损伤或功能障碍可能在激素性ONFH的发病机制中发挥重要作用[5-7]。MicroRNAs(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码的小RNA，在转录后水平通过RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex,RISC）和其靶基因3′非翻译区（3′untranslated region,3′UTR）结合来调节靶基因行使功能。miRNA受到越来越多的关注，其不仅调控生物体的正常发育、组织平衡、生理功能，也参与疾病的发生、发展及康复等多阶段的复杂过程[3]。淫羊藿苷 （icariin,ICA；C33H40O15；分子量：676.67）是从淫羊藿中提取的黄酮类化合物，可以有效预防骨质疏松症、保护血管内皮细胞功能及预防激素性ONFH的发生[8～10]。作者所在团队前期体外实验研究表明ICA可能通过调控激素诱导BMECs中miRNA-23b表达失衡及保护BMECs的功能来预防激素性ONFH的发生[11，12]。现阶段该课题组通过建立大鼠激素性ONFH模型及ICA预防激素性ONFH模型组，分别提取不同组大鼠股骨头BMECs进行原代培养，通过动物体内试验进一步验证ICA是否可保护BMECs的功能，同时采用mi-RNAs基因芯片进一步探寻激素性ONFH发生时BMECs中miRNA-23b表达是否发生改变；ICA对异常表达的miRNA-23b是否有调控作用，来验证前期研究的结论及观点。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

该动物实验研究程序严格遵守世界医学协会《赫尔辛基宣言》所规定的国际规则和条例。实验前，90只8周龄雌性SPF级SD大鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司）置于特定无病原体条件下适应性饲养1周（环境温度 20℃，光照/暗循环 12 h，湿度48% ）。标准的啮齿动物饲料饲养。ICA（批号：II0030，中国，索莱宝科技有限公司）；内皮细胞培养基（货号：1001，美国，Sciencell）；离心机（型号：8622，日本，久保田）；脂多糖（货号：L2880，美国Sigma公司）；甲强龙（货号：H20080284，美国，辉瑞制药公司）；芯片扫描仪（型号：G2565CA，美国，Agilent公司）；CX41荧光显微镜（型号：CX41日本，Olympus公司）。

1.2 体内实验

1.2.1 动物分组与处理

90只雌性SD大鼠采用随机数字表法分为三组，每组30只。模型组：腹腔连续注射2次脂多糖（20 μg/kg），每次间隔24 h，24 h后肌内连续注射3次大剂量甲强龙（40 mg/kg），每次间隔24 h，同时给予与ICA组等量生理盐水灌胃。ICA组：大鼠给予脂多糖及甲强龙的剂量及时间同模型组，首次肌注脂多糖后给予大鼠ICA（每天60 mg/kg）灌胃，连续灌注4周。空白组：仅给予等量生理盐水腹腔注射、肌注及灌胃。4周后处死大鼠，随机选择各组动物进行实验。

1.2.2 骨形态计量分析

三组大鼠每组随机取10只大鼠股骨头行HE染色，病理变化由两位独立观察者进行评估。采用im⁃age-pro-plus图像分析系统计算单位面积的骨小梁面积百分比、骨小梁宽度和空骨陷窝率。

1.3 体外实验

1.3.1 BMECs分离与鉴定

采用作者所在实验室前期建立的BMECs分离培养方法完成大鼠股骨头BMECs的提取及鉴定[3]：每组20只大鼠均采用脱臼法处死后，75% 酒精浸消毒。后外侧入路取出股骨头，去除软骨后，将股骨头用组织剪切为1 mm3碎骨粒。装入含有10 ml DMEM培养基的离心管中，DMEM培养基清洗骨粒2次。离心管内加入含0.2% I型胶原酶的DMEM培养基2 ml，37℃水浴消化30 min，随后加入0.25% 胰蛋白酶消化5 min。采用200目细胞筛过滤，将滤液置于4℃、430×g离心机中离心6 min。将细胞接种在35 mm直径培养皿中，放入37℃、5% CO2、95% 湿度的细胞培养箱中培养。72 h后磷酸盐缓冲液冲洗一次弃去未贴壁的细胞，重新更换培养基，以后每3～5 d更换培养基1次，倒置显微镜下观察细胞形态；每组随机取1份细胞行流式细胞仪对股骨头微血管内皮细胞特异性抗原CD31和Ⅷ因子相关抗原（vWF）进行鉴定。

1.3.2 BMECs细胞凋亡检测

每组取15只大鼠的BMECs行流式细胞仪凋亡检测。BMECs培养皿中加不含EDTA的胰蛋白酶消化后离心（2 000 r/min，5 min）。PBS洗涤2次，以1～5×105/管收集细胞，PBS洗涤1次，离心去除PBS，加入冰预冷的70% 的乙醇固定，离心弃去固定液，3 ml PBS重悬5 min，400目筛网过滤，离心（1 000 r/min，5 min）弃去PBS，加入1 ml PI染色，4℃冰箱冻存30 min后行流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.3 BMECs细胞miRNA-23b检测及生物信息学分析

每组取3只大鼠BMECs样本进行生物信息学分析。使用TRIzol试剂（按照说明书操作步骤进行操作）对BMECs进总RNA提取质检。质检合格的to⁃tal RNA进行纯化、去磷酸化及标记。随后使用Agi⁃lent芯片扫描仪对甩干的芯片进行扫描及数据提取，分析miRNA-23b表达量。利用Gene Ontology（GO）软件对miRNA-23b调控靶基因进行功能注释分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析；计量数据以±s表示；资料呈正态分布时，两组间的比较采用独立样本t检验，多组间比较单因素方差分析，两两比较采用LSD法；资料呈非正态分布时，采用秩和检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 组织观察与形态计量结果

三组股骨头组织学HE染色观察见图1。空白组骨小梁排列整齐，无明显变薄、破裂（图1a），小梁内可见大量散在蓝色骨细胞核和微血管（图1d）。模型组出现早期骨坏死表现，骨小梁稀疏、断裂，小梁间隙变宽，小梁间隙充满大量纤维化组织（图1b），骨小梁内可见大量空骨陷窝（图1e）。ICA组股骨头解剖结构（图1d）与空白组组解剖结构相似，骨小梁中可见散在蓝染的细胞核、空骨陷窝及微血管（图1f）。

图1 三组动物股骨头组织学观察（HE） 1a～1c:低倍镜下所见 1a:空白对照组（×100），骨小梁排列整齐，无明显变薄及断裂，散在大量微血管 1b:模型对照组（×100）：骨小梁稀疏、断裂，空骨陷窝较多，未见微血管 1d～1f:分别为上述三组黑色框部分高倍镜下（×200）所见 1d:黑色箭头为骨陷窝，红色箭头为微血管 1e:黑色箭头为空骨陷窝 1f:黑色箭头为骨细胞，红色箭头为微血管，黄色箭头为空骨陷窝

组织形态计量结果见表1，模型组股骨头骨小梁的宽度明显低于空白组与ICA组（P<0.05），空白组股骨头骨小梁的宽度与ICA组之间无明显差异（P>0.05）；模型组股骨头骨小梁面积百分比明显低于空白组与ICA组（P<0.05），空白组股骨头骨小梁面积百分比与ICA组之间无明显差异（P>0.05）；模型组的空骨陷窝率明显高于ICA组（P<0.05）。

表1 三组大鼠股骨头形态计量检测结果（±s）与比较

表1 三组大鼠股骨头形态计量检测结果（±s）与比较

指标骨小梁宽度（μ m）骨小梁面积百分比（% ）空骨陷窝率（% ）空白组（n=1 0）8 6 2.1 7±1 5 3.8 2 5 3.4 3±3.3 1 0模型组（n=1 0）4 0 7.5 4±1 4 1.1 7 3 5.6 8±5.6 9 3 2.5 1±1 3.8 1 I C A组（n=1 0）8 3 6.5 0±1 3 2.1 6 5 2.5 9±3.2 2 1 3.7 7±5.5 4 P值0.0 2 4 0.0 1 8 0.0 4 1

2.2 BMECs鉴定

BMECs细胞鉴定结果见图2。接种48 h后换液，荧光显微镜下可见少量散在贴壁长梭形细胞（图2a），接种5 d后可见明显细胞集落（图2b），接种12 d后细胞铺满培养皿底，并呈现铺路石样外观（图2c）。流式细胞仪检测BMECs特异性抗原分子，99% 的细胞同时表达CD31和vWF（图2d）[13]。

图2 股骨头BMECs培养鉴定 2a:少量散在贴壁长梭形细胞（×40） 2b:可见明显细胞集落（×40） 2c:细胞铺满培养皿底，并呈现铺路石样外观（×40） 2d:流式细胞仪检测细胞高表达CD31和vWF

流式细胞仪BMECs细胞凋亡检测结果见表2，三组间坏死细胞百分比的差异无统计学意义（P>0.05）。BMECs活细胞比率由高至低依次为：空白组>ICA组>模型组，差异有统计学意义（P<0.05），其中，模型组BMECs活细胞比率明显低于空白组和ICA组（P<0.05），而空白组和ICA组活细胞百分比无显著差异（P>0.05）。早期凋亡细胞比率由高至低依次为：模型组>ICA组>空白组，差异有统计学意义（P<0.05），其中，模型组早期凋亡细胞比率明显高于空白组（P<0.05），空白组与ICA组早期凋亡细胞比率的差异无统计学意义（P>0.05）。三组间晚期凋亡细胞比率的差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 三组大鼠股骨头BMECs细胞凋亡检测结果（% ，±s）与比较

表2 三组大鼠股骨头BMECs细胞凋亡检测结果（% ，±s）与比较

指标坏死细胞比率活细胞比率早期凋亡细胞比率晚期凋亡细胞比率空白组（n=1 0）9.2 3±6.5 0 7 7.1 5±4.1 6 5.6 4±3.9 7 1 5.3 7±3.7 7模型组（n=1 0）1 1.3 7±5.4 0 5 7.2 4±6.2 1 5.9 2±1 0.3 8 1 4.8 2±7.8 3 I C A组（n=1 0）7.8 9±3.4 9 7 0.1 4±5.5 3 1 0.9 2±6.2 0 1 2.5 1±3.2 3 P值0.3 4 6<0.0 0 1 0.0 2 2 0.1 0 7

2.3 miRNA-23b检测结果及生物信息学分析

miRNA信号变化聚类分析与GO功能注释详见图3。与空白组相比，模型组miRNA-23b表达下调，差异有统计学意义（P=0.032），ICA组miRNA-23b表达量与空白组比较仍然下降，但差异无统计学意义（P=0.079）；但miRNA-23b在ICA组中的表达量高于模型组。因此，ICA对糖皮质激素诱导的BMECs中miRNA-23b的异常表达有一定的调控作用。经GO数据库对miRNA-23b靶基因参与的细胞室 （cellular compartment）、分子功能 （molecular function）和生物过程（biological process）进行了标准化描述，详见图3b。

图3 生物信息学分析 3a:模型组和ICA组与空白组大鼠BMECs比较差异表达的miRNA聚类分析 3b:GO功能注释。蓝色条带代表生物学过程，黄色条带代表分子组分，红色条带代表分子功能

3 讨论

自Lee[14]首次发现miRNA以来，越来越多的miRNAs被发现，miRNA也成为了医学研究的热点。miRNAs在细胞中对mRNA和蛋白质的表达有一定的调控作用，因此，miRNA的异常表达与许多疾病的发生发展有关[15]。miRNA异常表达的发现为ONFH的诊治及预防提供了新的思路。BMECs参与骨吸收、新骨形成、血管生成、营养物质和代谢物质的运输、维持骨微环境的平衡等多种生理及病理过程[16]。早在 1948 年，Chandeler等[17]研究发现 ON⁃FH发生的原因可能是微血管损伤。Séguin等[18]和Kerachian等[19]也发现内皮功能障碍与非创伤性ON⁃FH发病密切相关。因此，在基因水层面研究股骨头BMECs具有重要意义，有助于识别药物作用靶点及相关信号通路等。

ICA是中药淫羊藿的有效活性成分，Hu等[20，21]发现ICA可有效抑制氧化低密度脂蛋白引起的人脐静脉内皮细胞损伤和凋亡及缺氧引起的腕静脉内皮细胞损伤。作者所在团队体外实验研究表明ICA可有效抑制激素诱股骨头BMECs损伤[11]。现阶段本团队通过动物体内实验研究进一步验证，ICA可有效保护激素诱导的BMEC损伤，降低BMECs的凋亡率。有研究表明，ICA具有性激素样作用，其可有效促进骨组织蛋白合成和成骨细胞生长，从而有利于骨组织再生及修复[22，23]。本中心组织的一项多中心随机双盲对照试验证实，服用主要成分为ICA的仙灵骨葆胶囊可有效降低激素性股骨头坏死的发病率[22]。本团队前期实验研究也表明，ICA可促进动物体内的内皮细胞增殖、迁移、成管，促进微血管形成，改善微循环，促进骨组织修复，延缓股骨头坏死病情的进展[24]。作者通过动物实验也揭示了，ICA可有效的预防激素性股骨头坏死的发生。

miR-23b是一种多功能的非编码mi-RNA，具有调控血管生成的作用，尤其在富含血管内皮细胞的组织中高表达如心脏、肺等[25]。miRNA-23b的靶基因及多条相关信号通路，在细胞凋亡、增殖、分化，血管形成及干细胞分化方面具有重要的调节作用[11]。Zhou 等[26]研究发现 miRN-23b 的表达与调节血管内皮细胞功能及调控血管的完整性相关，miR⁃NA-23b过表达可能与血管的新生有关。赵丁岩等[11]研究表明上调miRNA-23b可能抑制BMECs的凋亡和促进新生血管形成。作者前期体外实验研究表明，激素可抑制BMECs中miR-23b的表达；BMECs经ICA干预后，可有效的调控激素对miR⁃NA-23b表达量的影响，同时推测ICA可能通过调控骨微血管内皮细胞miR-23b的表达量来参与激素性股骨头坏死病理过程的调控[11]，同时作者也发现ICA在体外可促进微血管生成，而且可以增加激素诱导后大鼠股骨头微血管的密度。该系列研究提示ICA在预防糖皮质激素诱导的ONFH中具有一定的作用[24]。现阶段，本研究通过动物体内实验进步验证了ICA对激素诱导的miR-23b表达量的下降有一定的调控作用。这为下一步深入研究股骨头坏死的发病机制，探究ICA的作用靶点奠定良好基础。

该研究存在以下不足之处:（1）体内研究表明，ICA对激素诱导miRNA-23b表达量的下降有一定的调控作用，但miRNA-23b的表达量未完全恢复到正常值，因此ICA的最佳给药剂量可能需要进一步探索；（2）前期研究预测的miRNA-23b靶基因可能调控的信号通路及现阶段对miRNA-23b靶基因功能注释分析，需要进一步研究；（3）前期实验已验证Agi⁃lent芯片检测miRNA 表达量的准确性[3，11]，因此该研究没有对miRNA-23b表达量进行PCR验证。

ICA在动物体内可有效的预防激素诱导的ONFH的发生，同时可保护BMECs，BMECs中的miRNA-23b可能是ICA预防激素性股骨头坏死的作用靶点。