基于网络药理学研究黄连温胆汤干预2型糖尿病作用机制*

王明坤 程 俐 赵 鑫 李爱玲

滕州市中医医院1内分泌科，2重症医学科，山东枣庄 277599

据统计，全球约有4.25亿2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者，且这一人数在2045年将达到6.93亿[1]。长期高血糖的刺激可使T2DM患者出现心血管疾病、高血压病、糖尿病足等并发症[2]，严重影响患者的生活质量[3]。T2DM属于中医学“消渴病”范畴，中医药对T2DM的研究历史悠久。黄连温胆汤由温胆汤化裁而来，首见于《六因条辨》，其治疗T2DM效果显著，但具体作用机制尚不明确[4-5]。本研究拟借助时下新兴的网络药理学(network pharmacology，NP)理论和工具，构建“黄连温胆汤活性成分-T2DM相关靶点”的复杂网络，挖掘黄连温胆汤干预T2DM潜在机制，为T2DM的临床治疗和基础研究提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 黄连温胆汤药物成分筛选

黄连温胆汤由黄连、半夏、陈皮、枳实、瓜蒌、茯苓、白术、丹参、葛根、大黄、黄芩等组成。检索西北农林科技大学设计开发的中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)，对黄连温胆汤所含药物的所有成分进行挖掘整理[6]。药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是指药物经口服后被吸收进入人体循环的速度与程度，OB值越高则越有成为治疗药物的潜力；药物相似度(drug-likeness，DL)是指化合物与已知药物的相似性。以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件[7]，过滤获得黄连温胆汤药物有效成分，建立数据库。

1.2 黄连温胆汤药物成分潜在作用靶点收集

利用TCMSP数据库检索黄连温胆汤药物成分的潜在作用靶点并导出。登录UniProt(http：//www.uniprot.org/)数据库[8]，以UniProt Knowledgebase(UniProt KB)模块中“智人(Homo sapiens)”的注释信息为参照，校正黄连温胆汤药物成分潜在作用靶点名称。

1.3 T2DM靶点的获取及收集

基因卡片(Gene Cards，https：//www.genecards.org/)数据库系用于分析人类基因数据的综合数据库，该数据库集成了约150个基因网络数据库资源，内容涵盖基因组、转录组、蛋白质组、遗传等信息[9]。人类在线孟德尔遗传平台(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)系记录人类基因与遗传表型的数据库[10]。DisGeNET(http：//www.disgenet.org/)数据库是最大的包含人类疾病及相关基因靶点的数据库之一，包含17549种基因和24166种疾病[11]。以“diabetes”“diabetes mellitus”“type 2 diabetes mellitus”作为关键词检索上述3个数据库，经合并、去重后，获得T2DM 的相关靶点。

1.4 黄连温胆汤干预T2DM潜在靶点筛选

将检索获取的黄连温胆汤潜在靶点和T2DM相关靶点导入生物信息学与系统生物学网站，利用网站的韦恩图绘制功能(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)，将黄连温胆汤潜在靶点和T2DM相关靶点取交集，获得黄连温胆汤干预T2DM的潜在靶点，并绘制韦恩图。

1.5 “药物-成分-靶点-疾病”网络的构建

使用Cytoscape 3.8.2软件(http：//www.cytoscape.org)构建黄连温胆汤干预T2DM 的“药物- 成分-靶点-疾病”关系网络。运用Cytoscape软件中的cytoHubba插件，以网络节点度值为条件，进行拓扑分析，筛选获得网络中的核心成分和靶点。网络节点颜色越深，代表该靶点的网络节点度值越高，在网络中处于核心地位。

1.6 关键靶点信号通路富集分析

以R语言为平台，借助Bioconductor[12]和ClusterProfiler工具[13]，以P<0.05为条件，进行黄连温胆汤干预T2DM靶点的GO注释信息和KEGG信号通路富集分析，并将结果可视化。

2 结果

2.1 黄连温胆汤有效成分筛选及作用靶点预测

经筛选得到黄连温胆汤的有效成分有134个；经靶点模型预测、汇总并去重后，得到黄连温胆汤的作用靶点共253个。通过DisGeNET数据库、GeneCards平台和OMIM平台收集得到T2DM相关靶点1930个；将黄连温胆汤作用靶点和T2DM相关靶点取交集，获得黄连温胆汤干预T2DM的靶点133个。见表1及图1。

表1 黄连温胆汤有效成分及其干预T2DM的作用靶点

续表1

图1 黄连温胆汤作用靶点及T2DM相关靶点韦恩图

2.2 药物-成分-靶点-疾病网络构建

对黄连温胆汤干预T2DM的作用靶点进行关系网络绘制和统计，得到网络关系图，见图2。经拓扑分析，筛选出黄连温胆汤干预T2DM核心靶点，并构建网络图，见图3；得到槲皮素(MOL000098)、木犀草素(MOL000006)等有效成分以及PTGS1、PTGS2、AR等靶点度值较高。

图2 黄连温胆汤干预T2DM的药物-成分-靶点-疾病网络关系图

图3 黄连温胆汤干预T2DM核心成分、靶点筛选

2.3 关键靶点基因生物功能及通路分析

经R语言分析，得到黄连温胆汤干预T2DM靶点的GO注释信息，见图4。

图4 黄连温胆汤干预T2DM靶点的GO注释信息

KEGG信号通路富集分析结果见图5。

纵坐标为信号通路名称，横坐标为富集在该通路上的基因数，颜色越红代表基因在通路上富集程度越高图5 黄连温胆汤干预T2DM靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究经拓扑分析发现，槲皮素、木犀草素等有效成分是黄连温胆汤干预T2DM的主要有效成分，PTGS1、PTGS2、AR等基因是黄连温胆汤干预T2DM的核心靶点。经富集分析发现，黄连温胆汤干预T2DM的靶点显著富集于AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路上。

槲皮素广泛存在于植物中，如苹果、洋葱、石榴、山楂等，属于强抗氧化剂。槲皮素干预T2DM的作用机制包括刺激胰岛素分泌[14]，对胰腺或胰岛B细胞的抗氧化和抗炎保护等[15]。Yao等[16]开展的纳入16376人的横断面研究发现，中国人槲皮素的摄入量与T2DM患病率呈负相关，证实槲皮素可能有助于降低T2DM的发病风险。

木犀草素为天然黄酮类化合物，富含于胡椒、芹菜、胡萝卜和菠菜等食用植物中。α-葡萄糖苷酶是T2DM的关键酶之一。研究发现，木犀草素能够以非竞争性方式可逆地抑制α-葡萄糖苷酶的催化活性[17]。另有研究证实，木犀草素和木犀草素-7-O-葡萄糖苷可显著降低糖尿病模型大鼠血清和肝脏的三酰甘油水平，降低血糖、糖化血红蛋白的水平，并能减轻胰岛素抵抗[18]。木犀草素干预T2DM的机制尚未完全明确，有待进一步研究。

前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin endoperoxide synthase，PTGS)又称为环氧合酶(cyclooxygenase，COX)，是花生四烯酸代谢过程中的限速酶，与血小板活性以及炎症反应密切相关[19-20]。研究发现，糖尿病模型小鼠的血小板COX-1表达上调[21]；Finamore等[22]也证实葡萄糖浓度可影响COX-1 Ser 529残基的乙酰化水平，随着血糖浓度的升高，阿司匹林对COX-1的抑制作用呈减弱趋势。研究表明，二甲双胍与COX-2抑制剂联合使用可以降低类风湿关节炎和糖尿病患者再入院率，这可能与患者体内促炎因子受到抑制有关[23]。另有研究发现，木酸可降低糖尿病模型大鼠体内COX-2、TNF-α的水平，并抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性，通过抗高血脂、保肝、抗氧化和抗炎途径发挥干预糖尿病的作用[24]。COX-1和COX-2与T2DM的相关性研究较少，其具体机制有待进一步发掘。

雄激素受体(androgen receptor，AR)属类固醇受体，研究发现，AR基因第一外显子CAG重复次数与T2DM男性患者胰岛素抵抗和糖化血红蛋白水平密切相关[25]。Pujar等[26]利用生物信息学技术挖掘发现，AR与胰岛素抵抗关系密切，可能是胰岛素抵抗的核心基因之一。

晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)是由葡萄糖或其他糖(果糖和戊糖)对蛋白质、脂质和核酸等大分子进行翻译后非酶修饰而形成的异质分子。AGEs为有害分子，与T2DM[27]以及系统性红斑狼疮[28]、类风湿关节炎[29]等免疫疾病密切相关。AGEs通过与它们的受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)结合，可以促进氧化应激，导致促炎细胞因子和炎症反应的产生[30]。氧化应激可以干扰细胞内信号而促进病理状态的发生，特别是胰岛素介导的代谢反应和胰岛素抵抗[31]。此外，在与RAGE结合后，AGEs的积累会导致高血糖、高脂血症、炎症反应和内皮功能障碍等病理反应，加重代谢负担[32]。

IL-17由Th17细胞、CD8+T细胞和γδT细胞分泌，通过广泛存在于胰岛细胞表面的IL-17RA和IL-17RC受体复合物发挥调节作用，可通过直接诱导β细胞凋亡和增加局部细胞因子和趋化因子而加重胰岛炎症反应[33]。IL-17与1型糖尿病的相关性已得到证实[34]；近年来，IL-17在T2DM发病过程中的重要作用也已得到部分印证。Zhu等[35]研究发现，T2DM患者Foxp3+调节性T细胞和Foxp3-调节性T细胞中IL-17表达水平均显著升高，表达IL-17的Foxp3+调节性T细胞比例与体质量指数和糖化血红蛋白水平呈正相关。但IL-17与T2DM的相关性以及IL-17信号通路在T2DM发病过程中的机制尚未明确，这可能是探索T2DM发病机制和治疗靶点的新途径。

TNF信号通路是炎症反应的经典通路，炎症反应和糖毒性、脂毒性是目前公认的导致β细胞功能障碍和损伤的重要因素[36]。研究表明，妊娠期糖尿病患者血清糖化血红蛋白、转化生长因子β1与TNF-α水平较健康妊娠者高，且上述指标水平与患者胰岛素抵抗呈正相关，提示TNF-α参与T2DM发病，且炎症反应可影响胰岛素抵抗[37]。另有研究证实，T2DM患者唾液内C反应蛋白、IL-6和TNF-α水平高于健康人群，上述炎症标记物与T2DM患者的糖化血红蛋白水平呈正相关[38]。

综上，本研究运用网络药理学的研究方法发现，黄连温胆汤中的槲皮素、木犀草素等有效成分可通过干预PTGS1、PTGS2、AR等基因，调控AGE-RAGE、IL-17、TNF等信号通路，干预T2DM。上述结果可为T2DM的治疗和基础研究提供新的思路。