基于单链DNA-银纳米簇荧光探针对微囊藻毒素-LR 的检测研究

李秋旸，赖艳琼，杨新杰，庞鹏飞**，王红斌，张艳丽**，杨文荣

(1.云南民族大学 生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650500；2.迪肯大学 生命与环境科学学院，澳大利亚 吉朗 3217)

蓝藻水华是全球广泛关注的水环境污染问题之一，由于蓝藻毒素的释放，对公众健康和水体环境构成巨大威胁.微囊藻毒素（microcystins，MCs）是一种广泛分布的蓝藻毒素，是由淡水和微咸水中大量繁殖的蓝藻产生，对水生生态系统和人类健康造成巨大威胁[1].其中，微囊藻毒素-LR（microcystin-LR,MC-LR）是一种环状七肽肝毒素，是目前已知毒性最强、危害最大，且最为常见的一种蓝藻毒素[2].微囊藻毒素-LR 含有5 种非蛋白原和两个可变位置的亮氨酸（L）和精氨酸（R）（化学结构式见附件图S1），是最早被化学鉴定和广泛研究的微囊藻毒素[3-4].长期接触微囊藻毒素-LR 污染的饮用水或农产品可导致哺乳动物肝脏损伤，并通过抑制蛋白磷酸酶1 和2A（PP1 和PP2A）的活性而促进肿瘤的发生[5-6].由于毒性强且广泛存在，1998 年世界卫生组织（WHO）规定饮用水中微囊藻毒素-LR 的可接受上限水平为1 μg/L[7].因此，开发一种简单、灵敏、快速、可靠的检测低浓度微囊藻毒素-LR 的分析方法，对保证水质和保护人类健康具有重要意义.

迄今为止，人们已经开发出多种检测微囊藻毒素-LR 的分析技术，常见的有高效液相色谱−质谱法（HPLC-MS）[8-9]、蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）[10-11]、酶联免疫吸附法（ELISA）[12-14]及化学与生物传感器法[15-25].虽然这些检测技术和方法的准确度和灵敏度较高，但需要昂贵的仪器、训练有素的人员和耗时的操作过程，意味着其应用通常局限于资源充足和集中的实验室.因此，有必要建立一种简单、灵敏、特异的微囊藻毒素-LR 检测方法.近年来，基于抗原和抗体之间高特异性和有效识别的荧光分析技术引起研究者的关注，构建不同类型的荧光传感分析技术用于微囊藻毒素-LR 检测[26-29].

金属纳米簇（metal nanoclusters）是一类新型功能纳米材料[30]，是由几个到几十个金属原子组成的团簇，直径通常小于2 nm.由于其独特的物理和化学性质，如超小尺寸、HOMO-LUMO 跃迁、强的发光性能及良好的稳定性和生物相容性，在生物传感、催化、标记、成像和治疗等领域具有广阔的应用前景[31].银纳米簇（silver nanoclusters）是一种具有荧光的纳米团簇[32]，由于其相对简便的制备方法、超小的尺寸、较强的荧光及荧光量子产率和高稳定性，成为目前备受关注和研究最广泛的金属纳米簇，已被用于细胞成像、离子检测、化学传感等领域[33-36].与传统的有机荧光染料和有毒的荧光量子点相比，银纳米簇具有毒性低、荧光性能稳定、生物相容性好、发射波长可调和易于制备等优点，广泛用于荧光传感分析中[32].本研究以微囊藻毒素-LR 适体单链DNA 为模板，制备了单链DNA-银纳米簇（ssDNA-Ag NCs）荧光探针，构建了一种无酶无标记检测微囊藻毒素-LR 的荧光传感分析新方法，实现对微囊藻毒素-LR 的快速和超灵敏检测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂F-7000 荧光光谱仪（日本株式会社日立制作所）；TU-1950 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；JEM-2100 透射电子显微镜（日本电子株式会社）；WFH-203B 暗箱式三用紫外分析仪（上海驰唐电子有限公司）；TGL-16G 离心机（上海安亭科学仪器厂）.

微囊藻毒素-LR（microcystin-LR，MC-LR，下同.产品编 号：PN 300632）、微囊藻毒素-RR（microcystin-RR，MC-RR，下同.产品编号：PN 300636）和微囊藻毒素-LA（microcystin-LA，MC-LA，下同.产品编号：PN 300628）均购于上海普迈生物科技有限公司；硝酸银（AgNO3）和硼氢化钠（NaBH4）购自国药集团化学试剂有限公司；单链DNA 由宝生物工程（大连）有限公司合成并纯化，碱基序列详见表1.所用试剂均为分析纯，使用时未经进一步纯化，实验用水为灭菌去离子水.

表1 单链DNA 碱基序列Tab.1 Sequence of single-stranded DNA(ssDNA)

1.2 ssDNA-Ag NCs 的制备根据文献报道方法[37]改进后制备ssDNA-Ag NCs 荧光探针.以ssDNA的3′-端为模板合成Ag NCs，用pH 7.0 的PBS 缓冲液配制20 μmol/L Aptamer（Apt）溶液（含9 mmol/L Mg2+），按 照nDNA∶nAgNO3∶nNaBH4=1∶6∶6，在250 μL 20 μmol/L Apt 溶液中 缓慢加 入250 μL 120 μmol/L AgNO3溶液，于旋涡震荡器上剧烈震荡1 min，室温下避光反应30 min 后，再缓慢加入250 μL 120 μmol/L NaBH4溶液，于旋涡震荡器上剧烈震荡1 min，4 ℃下避光反应5 h，得到ssDNA-Ag NCs 溶液.

1.3 微囊藻毒素-LR 检测分析取10 μL ssDNAAg NCs 溶液，用10 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.0）稀释后，加入不同质量浓度的目标物MC-LR，37 ℃下培育60 min，测定其荧光光谱.设置激发波长为547 nm，扫描560～700 nm 范围内的光谱，扫描速率为240 nm/min，激发和发射狭缝均设置为10 nm.

对于实际水样的测定，取3 种不同水样（饮用水、湖水和自来水），用0.2 μm 的滤膜过滤，灭菌处理后，同上方法测定MC-LR 质量浓度，并进行加标回收实验.

2 结果与讨论

2.1 荧光探针的检测原理ssDNA-Ag NCs 荧光探针的制备及检测MC-LR 的原理如图1 所示.设计的适体单链ssDNA 既能作为模板合成ssDNAAg NCs，同时又能与目标分析物MC-LR 通过高亲合力特异性结合.合成的ssDNA-Ag NCs 在597 nm处有具有较强且稳定的荧光.当存在目标分析物MC-LR 时，由于适体单链ssDNA 与MC-LR 之间的特异性亲合作用力强于ssDNA 与Ag NCs 的相互作用力，导致Ag NCs 释放出来，荧光强度减弱.根据ssDNA-Ag NCs 荧光强度变化与目标分析物MC-LR 质量浓度之间的关系，实现对目标物MCLR 的定量检测.

图1 基于ssDNA-Ag NCs 荧光探针检测MC-LR 原理示意图Fig.1 Schematic illustration of the detection principle for microcystin-LR based on ssDNA-Ag NCs fluorescent probe

2.2 ssDNA-Ag NCs 的表征采用透射电镜（TEM）对制备的ssDNA-Ag NCs 进行形貌表征，如图2 所示，ssDNA-Ag NCs 分散度较好，尺寸分布较为均匀，平均粒径为2 nm 左右（图2（a））.当加入MCLR 后，由于适体单链ssDNA 与MC-LR 特异性结合，导致Ag NCs 释放出来，且发生聚集（图2（b）），表明ssDNA 与MC-LR 的亲合力强于Ag NCs.图3为ssDNA-Ag NCs 的荧光和紫外−可见光谱，曲线a 为ssDNA-Ag NCs 荧光激 发光谱，激发波长为547 nm，曲线b 为ssDNA-Ag NCs 荧光发射光谱，发射波长为597 nm.ssDNA-Ag NCs 的紫外−可见吸收光谱中，547 nm 处有一个强的特征吸收峰（曲线c），且与荧光激发峰对应.合成的ssDNA-Ag NCs 在365 nm 紫外灯下呈现红色荧光，在可见光下呈现无色（附件图S2），与文献报道结果一致.

图2 Ag NCs 的透射电镜图Fig.2 TEM image of prepared Ag NCs

图3 ssDNA-Ag NCs 的荧光和紫外−可见光谱图Fig.3 Fluorescent and UV-vis absorption spectra of ssDNAAg NCs

2.3 荧光猝灭效应为了验证实验的可行性，我们研究了ssDNA-Ag NCs 荧光强度在加入MC-LR前后的变化.如图4 所示，当不存在MC-LR 时，ssDNA-Ag NCs 探针在570 nm 处呈现出良好的荧光信号（曲 线a）；当加入500 μg/L MC-LR 时，ssDNA-Ag NCs 的荧光强度显著降低（曲线b）.实验结果表明，ssDNA-Ag NCs 可以作为荧光探针，根据荧光信号的猝灭程度对MC-LR 进行定量分析.

图4 ssDNA-Ag NCs 的荧光光谱图Fig.4 Fluorescent spectra of ssDNA-Ag NCs(a)in absence and(b)in presence of 500 μg/L MC-LR

2.4 实验条件优化为了获得最佳的荧光分析性能，对实验条件（Apt 浓度，探针制备条件，缓冲液pH 值，Mg2+浓度和孵育时间）进行了优化，如附件图S3 所示.随着适体链Apt 浓度的增加，ssDNAAg NCs 探针的荧光强度逐渐增强，当Apt 浓度为20 μmol/L 时，荧光强度达到最大（附件图S3A）.因此，实验选择20 μmol/L 作为Apt 最佳浓度.AgNO3与NaBH4的加入量影响ssDNA-Ag NCs 的荧光强度，如附件图S3B 所示，当加入Apt、AgNO3和NaBH4的物质的量之比为1∶6∶6 时，合成的ssDNAAg NCs 荧光强度最大.ssDNA-Ag NCs 的荧光强度也受到合成时间影响，当合成时间为5 h 时，探针的荧光强度最大（参见资料附件图S3C）.ssDNAAg NCs 的荧光强度与缓冲液pH 的关系如资源附件图S3D 所示，当缓冲液pH 为7.0 时，探针的荧光强度最强（资源附件S3D）.Mg2+浓度影响DNA 模板法合成Ag NCs 的荧光强度，如附件图S3E 所示，探针荧光强度随Mg2+浓度增加而增强，Mg2+浓度为9 mmol/L 时，荧光强度达到最大.对MC-LR 的检测，优化了ssDNA-Ag NCs 与MC-LR 的孵育时间，如资源附件图S3F 所示，随着孵育时间的增加，探针荧光强度逐渐减小，当孵育时间为60 min 时，荧光猝灭效应达到平衡.因此，选择60 min 作为检测MC-LR 的最优孵育时间.

2.5 微囊藻毒素-LR 测定在上述优化实验条件下，测定不同质量浓度MC-LR 对ssDNA-Ag NCs探针的荧光猝灭（图5）.如图5（a）所示，随着MCLR 质量浓度的增加（0,0.05,0.1,0.5,1,5,20,100,500,1 000 μg/L），ssDNA-Ag NCs 的荧光强度逐渐减小.ssDNA-Ag NCs 荧光强度的猝灭值与MC-LR质量浓度在0.05～1 000 μg/L 范围内呈良好的线性关系（图5（b）），其线性方程为F=−8.89lg[ρ/(μg/L)]+78.13，检出限（S/N=3）为16 ng/L，相关系数（r2）为0.9912.附件表S1 对比了本工作与已报道工作检测MC-LR 的分析效能，由表S1 可见，本工作分析效能与文献报道工作相当，但本工作具有荧光探针制作简单、无需标记等优点.

图5 不同质量浓度MC-LR 对ssDNA-Ag NCs 探针的荧光猝灭Fig.5 (a)Fluorescent spectra of ssDNA-Ag NCs with different MC-LR concentrations;(b)Relationship between fluorescent intensity of ssDNA-Ag NCs and MC-LR concentrations

2.6 抗干扰实验为了评价ssDNA-Ag NCs 荧光探针的抗干扰能力，考察了水体中MC-LR 共存的2 种异构体（MC-RR 和MC-LA）对荧光探针检测MC-LR 影响.如图6 所示，当MC-LR 质量浓度为20 μg/L 时，5 倍过量的MC-RR 和MC-LA 对荧光探针测定MC-LR 的干扰较小，表明制备的荧光探针具有良好的抗干扰能力，可用于实际样品的分析测定.

图6 ssDNA-Ag NCs 荧光探针的抗干扰实验Fig.6 Anti-interferent experimental results of ssDNA-Ag NCs fluorescent probe

2.7 实际样品测定为了验证该荧光探针对实际样品中MC-LR 检测的可行性，选取3 种水样（饮用水、湖水和自来水）作为实际样品，采用加标回收法测定荧光响应和回收率.水样经0.2 μm 的滤膜过滤，灭菌处理后，测定其对MC-LR 的荧光响应，测定结果如表2 所示.该荧光探针测定实际水样中MC-LR 的回收率为94.0%～106.5%，且相对标准偏差（RSD）为1.34%～2.72%，表明ssDNA-Ag NCs荧光探针对实际水样中MC-LR 测定具有可行性.

表2 ssDNA-Ag NCs 荧光探针对3 种实际水样中MC-LR的测定结果Tab.2 Determined results of MC-LR in three real samples using ssDNA-Ag NCs fluorescent proben =3

3 结论

本文以MC-LR 适体单链为模板，成功制备了ssDNA-Ag NCs 无酶无标记荧光探针，用于MCLR 的传感检测.该适体单链既可作为模板合成具有稳定荧光的Ag NCs，又能与目标物MC-LR 高亲和性和高特异性结合，导致体系荧光猝灭.实验结果表明，ssDNA-Ag NCs 荧光探针制备简单，且具有良好的生物相容性、高的荧光强度和荧光寿命.根据荧光猝灭效应，建立了荧光法测定MC-LR 的分析检测方法，该法具有灵敏、无需任何标记、操作简单等优势，为环境水样中MC-LR 快速和准确测定提供新的方法.