睡眠方颗粒剂对对氯苯丙氨酸致失眠大鼠单胺类神经递质的影响

马泽彬，王书玉，闫 欣，许大庆

中国有45.4%的被调查者在过去1个月中曾经历过不同程度的失眠[1]。改善睡眠习惯可以使一部分人们改善失眠状态，但是也有一部分人们即便改善了睡眠习惯，也依旧难以入睡。研究显示睡眠时间过短、失眠或睡眠障碍与高血压、糖尿病和肥胖具有一定的关联性[2]。目前临床治疗失眠的药物品种较多，但是长期使用的风险有所增加，会造成失眠病人出现戒断症状，如情绪激动、易怒忧郁、心跳加快，胃部不适，甚至产生健忘症等，同时也逐渐增加了药物的耐药性，不断增加药量造成反复循环的过程，最后服用药物也不能有效治疗失眠症。本文研究采用睡眠方丸剂治疗失眠，将其制备成颗粒剂便于服用,观察睡眠方颗粒剂的作用机制，并设置高、中、低剂量组，寻找合适的剂量，便于临床使用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 动物： SPF级雌雄各半健康SD大鼠60只，体重(180±20)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，实验动物生产证号SCXK(宁)2020-0001，分笼进行饲料喂养。室温控制在20～22 ℃，相对湿度控制在45%～65%，自由饮水，适应性喂养1周，便于实验的开展。

1.1.2 试药：方剂由菟丝子、龙骨、香菇、藜芦、青盐、薰衣草、芒硝组成。本方所用药物如下：菟丝子(批号：1911319)、龙骨(批号：2003259)、香菇、藜芦(批号：1701155)、青盐(批号：1807084)、薰衣草(批号：1906150)、芒硝(批号：5660018091)，(药物换算单位：一两约等于18 g，一钱约等于3 g)。均购于银川市第一人民医院，且经鉴定符合国家药典标准。

1.1.3 试剂与仪器：5-HT Elisa试剂盒(产品批号：U4AQJA2PUG)、5-HIAA Elisa试剂盒(产品批号：BX9T335E23)、NA Elisa试剂盒(产品批号：7VEXVQE6QG)、 DA Elisa试剂盒(产品批号：IHUU7H8FAG)均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；PBS缓冲液(产品批号：0033519)购自上海逍鹏生物科技有限公司；对氯苯丙氨酸(PCAP)(产品批号：S02S11Y123233)购自上海源叶生物科技有限公司。连续波长及核酸蛋白微量检测酶标仪(产品型号：INFITEM200PRO)，购自瑞士Tecan；微型高速离心机。

1.2 方法

1.2.1 分组：将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照药睡眠方丸剂组和睡眠方颗粒剂高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组10只大鼠。除正常组外，其余各组大鼠均建立失眠模型。

1.2.2 模型建立：每天上午9点开始对大鼠腹腔注射对氯苯丙氨酸PCPA混悬液[350 mg/(kg·d)]，每日1次，连续注射3 d 进行观察，正常组大鼠腹腔注射等体积0.9%生理盐水。于第1次腹腔注射PCPA混悬液30 h 后，除正常大鼠外，其他组大鼠出现异常兴奋，大量活动且不停，提示造模成功。

1.2.3 给药方法：灌胃治疗，每天1次，连续灌胃7 d。其中正常组、模型组大鼠各0.9%生理盐水标准灌胃；阳性对照药睡眠方丸剂组3 g/kg标准灌胃；睡眠方颗粒剂高剂量组6 g/kg、中剂量组3 g/kg、低剂量组1.5 g/kg标准灌胃。

1.2.4 脑组织取材及处理：灌胃后第7天晚上开始禁食供水12 h，于第8天上午腹腔注射水合氯醛麻醉后全程在冰面上操作，进行断头处理，迅速取出大脑予以称重。后续工作在冰浴环境下进行，避免组织坏死，加同等体积的PBS洗去血液后，手动快速匀浆，待没有组织块后，按照Elisa试剂盒要求所有组织液离心10 min，取上清液根据各指标检测步骤进行操作并测定。

1.2.5 检测指标：测定比较各组大鼠脑组织神经递质 5-HT、5-HIAA、NA、DA含量。

2 结果

2.1 各组大鼠脑组织5-HT和5-HIAA的含量情况：与正常组比较，模型组大鼠脑组织5-HT含量显著下降(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照药睡眠方丸剂组，睡眠方颗粒剂高、中、低剂量组大鼠脑组织5-HT含量显著升高(P<0.05)；与阳性对照药睡眠方丸剂组比较，睡眠方颗粒剂高剂量组5-HT含量显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠脑组织5-HT和5-HIAA的含量比较

2.2 各组大鼠脑组织DA和NA的含量情况：与正常组比较，模型组大鼠脑组织DA含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照药睡眠方丸剂组、睡眠方颗粒剂高、中剂量组大鼠脑组织DA含量显著降低(P<0.05)，睡眠方颗粒剂低剂量组含量降低(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠脑组织DA和NA的含量比较

3 讨论

《景岳全书》曰：“及别无所累而常多不寐者,总属真阴精血不足,阴阳不交,而神有不安其室耳”[3]，失眠的病位与肾相关。失眠的病位与心相关。睡眠方是治疗失眠的经典药方[4]。本研究选择睡眠方丸剂作为阳性对照药，一方面肯定了睡眠方丸剂在临床中的作用；另一方面睡眠方颗粒剂是在原方的基础上，经过剂型改造后分为高、中、低剂量组进行研究，研究要证实通过剂型改造后睡眠方颗粒剂的作用是肯定的，同时找出最佳剂量便于临床剂量的确定。进一步确定睡眠方颗粒剂对单胺类神经递质的影响，探讨其初步的作用机制。

睡眠与觉醒节律所涉及的神经生理过程较为复杂[5]，很多学者发现单胺类神经递质如5-HT、5-HIAA、NE/NA、DA等是参与睡眠-觉醒机制的经典单胺类神经递质。李恒飞等[6]学者用吴茱萸敷贴涌泉穴，观察对失眠大鼠影响的动物实验研究认为，吴茱萸敷贴涌泉穴可通过兴奋五羟色胺能神经元，抑制蓝斑改善失眠。胡金霞等[7]学者观察景衣安神散穴位贴敷对失眠大鼠神经递质影响的研究中发现，失眠与神经递质水平的变化有关。其中5-HT及其代谢产物5-HIAA可以帮助改善睡眠，而DA及NA/NE含量升高能够引起觉醒，从而导致失眠的发生。胡文卓等[8]学者研究蛇床子中香豆素类成分佛手柑内酯对失眠大鼠神经递质的影响认为，佛手柑内酯的催眠作用与升高脑干内抑制性神经递质5-HT、5-HIAA含量，降低脑内兴奋性神经递质NE和DA含量相关，实验证实佛手柑内酯可以通过调节脑内兴奋性和抑制性神经递质的含量从而改善睡眠与觉醒周期，进而改善睡眠质量。本研究显示，睡眠方颗粒剂对治疗失眠大鼠具有一定的作用，但是剂量不同作用程度也不尽相同。与模型组相比，睡眠方颗粒剂高、中、低剂量组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA含量呈升高趋势，大鼠脑组织DA、NA呈下降趋势，说明造模成功。但与阳性对照药睡眠方丸剂组相比，睡眠方颗粒剂高剂量组大鼠脑组织5-HT含量2.49 μg/g，5-HIAA含量1.60 μg/g，呈升高趋势；NA含量1.66 μg/g呈降低趋势；DA含量2.70 μg/g，证明睡眠方颗粒剂高剂量作用优于阳性对照药睡眠方丸剂组。与阳性对照药相比，睡眠方颗粒剂中剂量组大鼠脑组织5-HT、5-HIAA、DA、NA含量无统计学差异。证明睡眠方颗粒剂中剂量作用与阳性对照药睡眠方丸剂组相似。与阳性对照药睡眠方丸剂组相比，睡眠方颗粒剂低剂量组大鼠脑组织5-HIAA、DA无统计学差异，5-HT含量下降、NA含量升高。证明睡眠方颗粒剂低剂量组作用劣于阳性对照药睡眠方丸剂组。由此可见，睡眠方颗粒剂高剂量组作用效果更好，更适合推荐临床使用。其作用机制是通过升高5-HT、5-HIAA，降低DA、NA含量而发挥作用。

本方的君药为菟丝子，始载于《神农本草经》，被列为上品[9]。菟丝子的功效为滋补肝肾，固精缩尿，安胎，明目，止泻。用于阳痿遗精，尿有余沥，遗尿尿频，腰膝酸软，目昏耳鸣，肾虚胎漏，胎动不安，脾肾虚泻。刘海云等[10]通过对大鼠使用对氯苯丙氨酸进行造模，研究菟丝子提取物对失眠大鼠神经递质含量的影响，发现菟丝子提取物可以改善大鼠失眠的情况，并通过改善失眠大鼠的学习记忆能力，升高血清中5-HT含量，降低DA含量发挥作用。菟丝煎由菟丝子、人参、山药等组成，杨志敏教授研究菟丝子认为：填精固肾，恢复肾主封藏的机能有益于部分慢性失眠患者康复[11]。菟丝子作为君药发挥着补髓填精，补益脾肾从而改善睡眠的作用；龙骨作为重镇安神药，镇静安神，治惊痫癫狂，怔忡健忘，失眠多梦[12]。《本草纲目》中认为龙骨可以“益肾镇惊”；香菇富含香菇多糖，具有多种药理活性，药用价值极高[13]，既具有抗抑郁、抗疲劳的作用，又可以间接保护长期失眠患者的神经系统；薰衣草很早就被用来提取制备成薰衣草精油从而起到治疗失眠的作用效果，研究显示[14]薰衣草精油起到安眠作用的是芳樟醇和其他几种成分的协同结果，其机制可能是通过调节单胺类神经递质的变化实现的。杨莹等[15]研究证明通过嗅觉途径吸入薰衣草精油就可以安全而有效地改善原发性失眠症患者的失眠情况。本方多种药物的作用机制都有不同程度改善睡眠的作用，说明作者选择使用该方作为研究方向是正确地，但是《名医别录》记载藜芦其“味苦，微寒，有毒”，张子和《儒门事亲》卷十四提到的十八反中指出“诸参辛芍叛藜芦”，藜芦的毒性作用大，应尽量避免内服。且本研究发现目前的药方成分中大量使用芒硝和青盐，口感偏咸的同时还会造成大鼠饮水量增加，间接说明芒硝和青盐会作用于肾脏，大量的盐性成分有可能会伤及肾脏。上述这三味药究竟发挥着怎样的作用，其毒性是否对患者用药产生作用，长期服用本药物是否发生毒性蓄积，等等，以上问题有待于进一步研究，这为本课题的研究提供了新的思路和方向，笔者会在此基础上继续研究，为失眠患者选择合理药物提供更多依据。