贵州喀斯特山区野生葛藤根瘤菌的资源利用

吉玉玉，曾庆飞，王海瑾，王佳楚函，欧二绫，韦兴迪，韦 鑫，龙忠富

(1.贵州省农业科学院草业研究所，贵阳 550006；2.贵州大学动物科学学院，贵阳 550006)

中国是世界上喀斯特地貌分布最广的国家之一，大陆上裸露、半裸露及埋于地下的碳酸盐岩分布面积约占全国总面积的三分之一，是我国亟需治理的生态脆弱区之一。

贵州省地处中国西部山区高原与东部丘陵平原之间的过渡区域，属于典型的喀斯特地貌[3]，是中国西南地区喀斯特面积最大、生态环境最复杂的省份[4]。研究表明，加快草地建设是喀斯特地区解决生态退化的有效途径[1]。喀斯特地区石漠化的本质是土壤退化，氮素大量流失，植被恢复慢。豆科植物作为世界重要的饲草种类之一，在改善土壤理化性质、提高土壤肥力等方面也占据重要地位，还可作为先锋植物为其他植物定居提供必要生长条件，被广泛用于生态恢复与重建[2]。豆科牧草野生葛藤(Puerarialobota)作为一种优良的水土保持植物、饲草植物和药用植物种质资源，在贵州境内广为分布[5]，具有生长迅速、根深叶茂、固氮增肥、改良土质等优良特性[6]。

根瘤菌-豆科植物共生固氮系统是生物固氮的主要体系。葛藤以结瘤数高、固氮率高、固氮量多[7]等优势改善石漠化地区土壤结构，提高土壤肥力[8]，用于荒山、荒滩改造和石漠化治理[9]，在修复污染退化土壤和植被生态的恢复等方面发挥巨大的作用[10-11]。目前国内针对葛藤根瘤菌的研究多集中在其遗传系统多样性上，如谢徽[12]探讨了四川攀枝花地区葛藤根瘤菌的遗传多样性和系统发育地位；陈强等[13]证明了23株四川葛藤属根瘤菌的遗传特性存在明显差异；魏世清[14]深入研究了葛藤根瘤菌的耐酸性等。贵州省内关于葛藤主要集中在其作为饲用植物资源方面的研究[15]，而针对环境特殊且资源丰富的贵州野生葛藤共生根瘤菌的研究还很缺乏[16]。

本研究利用采自贵州省不同生态功能区域的野生葛藤根瘤菌进行序列比对以及区系分析，并通过盆栽实验筛选出结瘤数多、固氮力强与促生效果优良的根瘤菌株，为贵州喀斯特地区植被恢复提供优异种质资源，为石漠化治理提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验区域与材料

1.1.1采集区域

样品采集于贵州省16个县(市)，遍布5个不同生态功能区[17]，不同生态区、采集地点及样品编号见表1。共采集到25份野生葛藤根瘤样品。

表1 样品编号及采集地点概况

1.1.2实验材料

百脉根“歌德”种子购于贵州省某园林绿化公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒购于北京百泰克生物技术有限公司；

1.1.3培养基

本试验对酵母甘露醇琼脂(YMA)培养基进行了改良，改良后的YMA液体培养基为：甘露醇10 g，MgSO40.2 g，K2HPO40.25 g，KH2PO40.25 g，CaSO40.2 g，NaCl 0.1 g，酵母粉1 g，适量蒸馏水混合后，加配制好的Na2MoO4(1%)、MnSO4(1%)、柠檬酸铁(1%)各1 mL，定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2。

分离纯化所用固体培养基则是在改良YMA液体培养基的基础上，加入琼脂粉16～18 g，刚果红(1%)2.5 mL混匀。

1.2 样品处理及分离纯化

样品处理：冲洗葛藤根瘤样品后无菌水浸泡过夜。挑选20～25颗单个根瘤依次用95%酒精、0.1% HgCl2浸泡5 min。

菌株分离：超净工作台内取无菌水冲洗过的单个根瘤，于1 mL无菌水的研钵中研磨成悬浊液，涂布于YMA平板上，28 ℃培养7 d，待出菌后每天观察。

菌株纯化：挑取单个菌落接种于新平板上，28 ℃倒置培养直至形成单菌落，重复2～3次，染色镜检(革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司)，获得纯化菌株。

菌株保存：纯化菌株接种至YMA液体培养基中，28 ℃、200 r/min 培养5～7 d后，30%甘油保种，-80 ℃冻存。

1.3 种类鉴定及区系分析

1.3.1形态学鉴定

镜检为红色的革兰氏阴性(G-)菌株，参照《微生物分类学》中鉴定方法[18]，观察菌体形态特征。

1.3.2菌株16 S rRNA基因序列分析

细菌基因组试剂盒提取菌株总DNA，各菌株16 S rDNA采用通用引物进行PCR扩增，预变性、变性、退火、延伸的条件分别为：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；54 ℃、1 min，72 ℃、2 min，35个循环；PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。测序完成后，利用NCBI的GenBank数据库、BLAST同源性比对，DNAMAN分析软件多重比对，最终结合菌体形态鉴定结果，确定各菌株的种属分类地位。

1.3.3区系分析

根据种类鉴定结果，系统分析调查区域内葛藤根瘤菌的种类及分布情况。分布频率采用相对频率和发生频率分别计算，计算公式：

相对频率(%)=(有某菌种发生的样品数/有菌种发生的总样品数)×100%；

发生频率(%)=(有某菌种发生的菌株数/鉴定出的菌株总数)×100%。

1.4 根瘤菌株的盆栽回接筛选

1.4.1供试菌株

根瘤菌株的代谢功能特性因地理环境与种类不同而有所差异[19]，又因回接筛选实验工作量较大，故供试菌株选择了不同地域、不同种类的具代表性的葛藤根瘤菌。

1.4.2盆栽回接方法

种子消毒：百脉根种子依次用酒精(75%)、次氯酸钠(3%)浸泡2 min、10 min。

菌液培养：供试菌株活化培养后，接种于YMA液体培养基中，28 ℃、200 r/min，培养5～7 d。

盆栽播种：在盛有灭菌珍珠石的花钵内播下种子，室温25 ℃、光照16 h/d培养。种子发芽长出幼苗后浇入Hoagland全营养液(上海国药)，3周后每盆保留10株幼苗用于菌液回接处理。

回接处理：以只浇灌无菌YMA液体培养基的花盆为空白对照(ck)，每3盆菌液回接(50 mL/盆)的花盆为1个处理，每个处理设3个重复。每隔1 d向花钵基质中浇灌少量的Hoagland营养液，仅保持基质湿润即可。菌液回接70 d、盆栽生长100 d后取出盆内植株，用于回接效果测定。

1.4.3测定植株结瘤数及地上、地下生物量

随机选取每一处理、每一重复中的3个百脉根植株，空白对照选取1株，共计10株。

统计并计算总瘤数及单株瘤数的平均值；分离地上部分和地下根系，于烘箱中105 ℃杀青30 min，降至65 ℃烘干至恒重，计算单株的地上和地下生物量的平均值。

1.4.4数据分析

采用Excel 2010软件整理数据，LSD法进行多重比较，SPSS软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 形态特征

经分离纯化和革兰氏染色鉴定，25份根瘤样品共获得53个(G-)纯化菌株。参照《微生物分类学》[18]，通过对菌体形态进行显微观察，发现符合根瘤菌的基本形态特征。

2.2 根瘤菌株的种类鉴定

按照1.3.2的方法，53个G-菌株的总DNA均形成23 kb左右的条带以及扩增约1.5 kb的序列片段。如表2所示，通过菌体形态特征以及16 S rDNA序列比对，共鉴定出共生根瘤菌39株，根瘤内生细菌14株。

表2 葛藤根瘤菌株种类鉴定结果

2.3 区系分析结果

如表3所示，53株野生葛藤根瘤菌分属于7个属17个种。7个属分别为：根瘤菌属(Rhizobium)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、草螺菌属(Herbaspirillum)和假单胞菌属(pseudomonas)。其中慢生根瘤菌属和假单胞菌属的分布频率最高，同时达24.39%，为优势属；在17个种中，根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)两个种的发生频率相对较高，分别达14.63%和12.20%，为优势种。

表3 葛藤根瘤菌株区系分析结果

表4展示了5个生态功能区葛藤根瘤菌的分类及种属分布结果。结果表明，南部干热河谷南亚热带季雨林生态区中鉴定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Burkholderia、Sinorhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas6属中的11个种，种类最多；其次是鉴定出Rhizobium、Bradyrhizobium、Agrobacterium和Pseudomonas4属中10个种的东部湿润亚热带常绿阔叶林生态区；而中部湿润亚热带喀斯特脆弱生态区和北部湿润亚热带常绿阔叶林生态区都只鉴定出Rhizobium和Herbaspirillum2个属中的2个种；西部半湿润亚热带针阔混交林、草山喀斯特脆弱环境生态区仅鉴定出Pseudomonas中的1个种。

表4 研究区野生葛藤根瘤菌种属分布特征

2.4 共生结瘤固氮高效根瘤菌株的筛选

2.4.1供试菌株

选用22株来自不同地域和不同种类葛藤根瘤菌用于百脉根幼苗的盆栽回接筛选实验。分别为：CZPR 19-1、CDPR 21-2、WMPR 27-2、LDPR 38-1、PKPR 45-1、LJPR 58-1、LXPR 59-2、SZPR 64-2、SZPR 66-1、SZPR 66-2、ZFPR 85-1、CLPR 294-1、CLPR 294-2、ZPPR 297-2、ZPPR 297-5、LGPR 299-2、LDPR 303-2、LGPR 306-2、TQPR 308-2、LLPR 327-1、DXPR 447-4、DMPR 453-1。

2.4.2葛藤根瘤菌株对百脉根共生结瘤及促生效果的影响

菌液回接70 d后，百脉根植株的相关指标测定结果见表5。结果表明，与ck相比，22个菌株回接后对幼苗共生结瘤和生长均有不同程度的促进作用。单株平均根瘤数在11～56个之间。结果显示，14个菌株(CZPR 19-1；CDPR 21-2；WMPR 27-2；LDPR 38-1；PKPR 45-1；LXPR 59-2；SZPR 64-2；SZPR 66-1；ZFPR 85-1；CLPR 294-2；ZPPR 297-5；LGPR 299-2；LDPR 303-2；DXPR 447-4)的结瘤促生效果较好，与其余菌株差异显著，为优良固氮菌株。其中分离自荔波县驾欧乡的LJPR 58-1的结瘤数和促生效应与其余13个优良菌株差异显著，与另外8个供试菌株的差异达极显著水平，为最优固氮根瘤菌株。

表5 百脉根盆栽回接筛选试验测定结果

3 讨 论

当前，葛藤在中国有17个种和2个变种，亦有部分研究学者认为在国内有18个种[20]，除新疆、西藏外，广泛分布于全国各省区[21]。贵州葛藤资源(1991—1995年)调查结果表明贵州省内存在10个种。作为全国葛藤资源集中分布的主要地区之一[22]，贵州省内关于野生葛藤共生根瘤菌的研究较少。

贵州境内葛藤根瘤菌区系分析发现，5个不同生态区的根瘤菌属、种数量各异，但每一个功能区中都存在根瘤菌属或假单胞菌属。已有的研究报道表明，与葛藤识别共生的根瘤菌存在着一定的优势种类，发现较多的是慢生根瘤菌属，同时也有根瘤菌属的报道[23-24]；在不同地区调查，葛藤根瘤菌均存在遗传多样性，在地理分布上，也均具有明显的生物学分布格局[25-27]。

本研究结果与已报道的研究结论有相似之处，慢生根瘤菌属是能与葛藤识别并共生的优势种类，但本研究结果还发现假单胞菌属中的部分种类也是与葛藤共生的优势种类，体现了贵州喀斯特地区的葛藤属根瘤菌资源存在着区域性的丰富性与特异性。进一步说明，与同一种豆科植物共生的根瘤菌资源，在不同的地区、不同的环境下均存在不同的优势种类，而根瘤菌在特定的生态地理环境下针对生物学地理分布、共生匹配效率与遗传多样性又会有显著的差异。因此，生态地理环境对共生根瘤菌资源的多样性具有重要的影响[28]。丰富多样的生态环境、不同的地理生态条件均会致使不同种类的根瘤菌与葛属植物共生结瘤，贵州作为喀斯特地区面积最大、生态环境最复杂的省份，从而导致了贵州喀斯特地区葛藤根瘤菌区域性的多样性，为贵州喀斯特地区石漠化治理提供葛藤这一豆科植物的优异种质资源，应用于生态恢复。

4 结 论

贵州岩溶山区广为分布的野生葛藤，作为一种既有饲用价值又有生态环境修复潜力的多年生豆科藤本植物，具有丰富的共生根瘤菌资源。贵州葛藤根瘤菌主要包括根瘤菌属、慢生根瘤菌属、伯克氏菌属、中华根瘤菌属、土壤杆菌属、草螺菌属和假单胞菌属7个属的17个种，其中优势属为慢生根瘤菌属和假单胞菌属，优势种为豆根瘤菌和根癌土壤杆菌。在采样涉及的5个不同生态功能区域中，每一区域除了都包含有慢生根瘤菌属或者假单胞菌属的根瘤菌以外，种属数量和区系分布特征另外还存在着明显的差异性，证明生态地理环境对葛藤根瘤菌的种类分布和多样性有着直接的影响。

本研究根据共生结瘤数、宿主植物地上部干重和地下部干重的影响效应三项指标，筛选获得了14株共生结瘤促生效果良好的根瘤菌，其中菌株LJPR 58-1被鉴定为优良菌株中的最优固氮根瘤菌，具有开发应用潜力。筛选结果说明，共生结瘤率极强的贵州野生葛藤蕴藏着丰富的优良抗逆根瘤菌资源，筛选出的优良菌株与葛藤和百脉根形成的优势固氮共生体系能有效应用于贵州岩溶山区草地生态畜牧和喀斯特环境修复的生产实际。