合理用药在恶性肿瘤患儿生育力保持中的意义及对策

王曼娜， 黄亮萍， 谢丽春， 陈运彬， 马廉△

1深圳市儿童医院血液肿瘤科(广东深圳 518038)； 2汕头大学医学院第二附属医院(广东汕头 515041)； 3广东省妇幼保健院(广东广州 511442)

恶性肿瘤是威胁儿童和青少年生命健康的重大疾病。现有数据显示，全球儿童癌症发病率均呈上升趋势，美国、加拿大和欧洲的年增长率分别为0.6%、0.96%、0.4%[1-3]。最新的一份来自30个省份215个癌症登记处的国家癌症中心统计报告显示，0～19岁的中国儿童恶性肿瘤发病率为96.03/百万，低于国际儿童癌症发病率第3卷(IICC-3)报告的结果，但却以每年2.8%的速度增长[1,4]。随着近年早期诊断、联合化疗方案的优化及靶向免疫治疗等医疗技术的进步，儿童恶性肿瘤的5年无病生存率已超80%，20年生存率达44.9%，其中生殖系统肿瘤、霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病长期存活比例分别占58%、48%和23%[5]。癌症特异性不育是影响恶性肿瘤幸存者整体生活质量的重要因素，恶性肿瘤患儿生育力保存已成为现代社会的重要公共卫生及科学问题[6]。根据2017年世界卫生组织报告，儿童恶性肿瘤的主要类型是白血病、中枢神经系统肿瘤、淋巴瘤、交感神经系统肿瘤、软组织肉瘤、肾脏肿瘤、骨肉瘤、生殖系统肿瘤、上皮肿瘤/黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。其中，白血病所占比例最高(34.1%)，其次是脑癌和神经系统癌症(18.1%)[7]。目前儿童恶性肿瘤的治疗方式，主要有化学药物、放射治疗、手术、造血干细胞移植(haematopoietic stem cell transplantation，HSCT)、靶向治疗和免疫治疗。治疗目标是提高生存率，同时最小化毒性和保持良好生活质量，采取综合治疗方案有利于取得期望目标。例如，手术干预和化疗的使用提高了儿童实体肿瘤(如骨肉瘤)的生存率。联合放疗和化疗可以提高霍奇金淋巴瘤患儿生存率。造血干细胞移植，在许多恶性肿瘤和骨髓功能缺陷性疾病中的作用被广泛认可[8]。对癌症幸存者的调查表明，绝大多数幸存者是希望将来能建立家庭并拥有自己的子女，特别是进入成年期的幸存者对生育能力的渴望更显著，但大多数人在癌症诊断时没有就癌症治疗的不良反应及关于生育力保存的选择进行充分的认识和专业咨询，从而错失了保存生育力的最佳时机。现就当前恶性肿瘤患儿治疗方式对生育力保存的影响及其预防措施作简要概述。

1 恶性肿瘤患儿治疗效果

急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是儿童期最常见的恶性肿瘤，占所有儿童恶性肿瘤的25%[9]。2020年国家儿童肿瘤监测中心发布的《国家儿童肿瘤监测年报2020》显示，我国儿童 ALL 发病率为(4～5)/百万，占儿童肿瘤发病率的第1位。化学药物治疗仍是目前儿童ALL的主要治疗方式，主要应用于第一阶段的诱导缓解治疗，采用的方案有VDLP(D)：长春新碱(VCR)、柔红霉素(DNR)、左旋门冬酰胺酶(L-asp)、泼尼松(PDN)或地塞米松(DXM)。在新诊断的ALL儿童中，有95%经过诱导化疗后达到完全缓解[10]。随着目前化疗方案的不断完善，ALL患儿的总体生存率可达90%，长期无病生存率达80%[11]。对于儿童成熟B细胞非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)(包括伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤)。目前国际上多采用FAB/ LMB 96一线治疗方案，主要化疗药物包括COPAD (环磷酰胺+长春新碱+泼尼松+多柔比星)，经过高强度、短疗程的化疗，成熟B细胞NHL患儿的2年总体生存率已接近90%[12]。目前一项国际性的前瞻性研究显示，利妥昔单抗和化疗联合应用可使中高危患儿成熟B细胞NHL的无事件生存率显著提高[13]。髓母细胞瘤(medulloblastoma，MB)是儿童最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，经手术、放疗和辅助化疗等规范的综合治疗，目前标危型的5年无复发生存率为70%～80%，而高危型5年无复发生存率约60%[14]。神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是影响儿童最常见的颅外实体瘤，约占儿童癌症的8%。高剂量化疗(high-dose chemotherapy，HDC)加自体干细胞移植(autologous stem cell rescue，ASCR)已成为改善高危儿童癌症预后的重要治疗策略，尤其是高危神经母细胞瘤(high-risk neuroblastoma，HR-NB)，在确诊病例中有35%为高危，长期生存率在50%左右。国内外报道，自体外周血造血干细胞移植(HSCT)治疗能改善HR-NB患儿的预后，5年无复发生存率为82.1%[15-16]。

2 恶性肿瘤幸存者生育力现状

恶性肿瘤治疗显著提高患者的生活质量，帮助他们积极面对自身疾病，并给患者提供未来生育希望，是目前恶性肿瘤治疗的策略之一。近40年，儿童恶性肿瘤的生存率才出现大幅提高，也就是说，长期影响直到现在才逐渐暴露，恶性肿瘤患儿的生育力评估越来越受到重视。恶性肿瘤幸存者在一生均面临着恶性肿瘤本身或者是治疗所致的并发症风险。2017年一篇刊登在《Lancet》杂志上的队列研究表明，多达99.9%的儿童恶性肿瘤幸存者罹患至少一种长期疾病，包括性腺损害，可能导致永久性无精子症或卵巢功能不全[17]。2016年国外一项孕产情况比较队列研究，共纳入儿童时期患恶性肿瘤的10 938例生存者与其无恶性肿瘤病史的3 949例兄弟姐妹，报告显示，恶性肿瘤存活者中位随访8年(IQR 4-12)的受孕率是38%，而其健康兄弟姐妹中位随访10年(IQR 6-15)的受孕率是62%[18]。也有研究表明，儿童急性淋巴细胞白血病女性幸存者的怀孕或出生率低于普通人群，同时接受放疗和化疗的男女性幸存者怀孕率显著降低[19-20]。一项德国队列研究显示，在存活5年或更长时间的霍奇金淋巴瘤女性患儿中，接受盆腔放疗比没接受过盆腔化疗的患儿生育率低(HR0.76，95%CI0.61～0.95；P=0.01)[21]。Green等[6]在一份儿童癌症幸存者报告指出，与年龄匹配的无肿瘤病史的兄弟姐妹对照组相比，儿童期罹患恶性肿瘤的成年男性幸存者后代减少了50%。St Jude终生队列研究报道，在214例未经放疗的儿童癌症成年男性幸存者中，环磷酰胺当量剂量(cyclophosphamide equivalent dose，CED)与精子浓度呈负相关，同时生育力受损还体现在精子运动能力下降和形态学改变[22]。

3 导致生育力损害的因素

3.1 恶性肿瘤对生育力的影响 恶性肿瘤细胞本身及其浸润，可以直接导致生殖腺、生殖干细胞和支持细胞的损害，细胞在恶变过程中表达或过表达肿瘤抗原，产生自身免疫抗体，攻击机体的正常组织细胞，进而介导细胞凋亡。肿瘤细胞产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)能损伤卵母细胞DNA双链，导致纺锤体缺陷、染色体错位和非整倍性，进而阻碍配子形成[23]。在女性肿瘤的研究中，有发现癌细胞还能通过microRNA介导颗粒细胞凋亡降低卵母细胞质量，如小儿急性淋巴细胞白血病细胞高分泌的miR-181a能靶向抑制去乙酰化酶SIRT1的活性诱导颗粒细胞凋亡损害卵泡发育[24]。白血病细胞能损害睾丸正常的生精功能，使精子的数目减少、活力低下和形态异常[25]。Petersen等[26]的研究表明，与普通人群相比，睾丸生殖细胞肿瘤患者的精子计数较低。睾丸癌患者的精子浓度中位数为2 200万/mL，每次射精的精子总量中位数为4 200万，而对照组精子浓度在(5 000～10 000)万/mL之间。睾丸原位肿瘤高表达与不育症相关的基因：KITLG、 BMP7、HOXD，这些基因既是致病基因，也是与不育症相关的基因[27]；睾丸原位肿瘤患者高表达与细胞凋亡、坏死、癌变等相关的蛋白，如CCT3、CCT6B、PSME4、S100A9等，睾丸肿瘤患者的精液蛋白组学异常是睾丸患者生育力低下的另一重要原因[28]。恶性肿瘤疾病本身的浸润和治疗不仅直接导致睾丸/卵巢生殖细胞的损害，也导致睾丸间质细胞和支持细胞、卵巢颗粒细胞等损害。一项大型儿童恶性肿瘤幸存者研究中指出，在癌症诊断后平均随访22年后，睾丸间质细胞衰竭和睾丸间质细胞功能障碍的患病率分别为6.9%和14.7%[29]。

3.2 化疗对生殖系统的影响 恶性肿瘤对患儿生育力的影响主要还是后续治疗引起的生殖损害。青春期前睾丸似乎比成人睾丸对肿瘤治疗更敏感，因为睾丸内的早期生殖细胞处于不断更新的状态[30]。恶性肿瘤男童青春期精子发生的建立受到肿瘤治疗对精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)的直接损害或者对支持细胞和Leydig细胞间接损害的影响，SSCs完全耗竭则会造成永久性无精子症[31-32]。不同化疗药物对睾丸生发上皮的细胞毒性作用以及对生育能力造成的受损程度受化疗的剂量和持续时间、患者年龄及其敏感度的影响[22]。化疗药物根据对生殖功能的损害程度分为高危(>80%致不育率)、中危和低风险药物(<20%致不育率)[33-34]。高风险类别包括烷化剂，如环磷酰胺、美法仑和异环磷酰胺，与铂类的机制一样，它们在脱氧核糖核酸(DNA)链之间形成共价键，干扰DNA复制过程中的裂解，导致细胞分裂中断。中危类药物包括紫杉类微管抑制剂，以及蒽环类抗生素，前者通过促进微管蛋白聚合，抑制解聚影响纺锤体的形成，使有丝分裂停滞，后者是通过将蒽环平面嵌入DNA碱基对中使DNA链裂解从而阻碍RNA转录，各种化疗药物的性腺毒性风险分类见表1。用高累积剂量的环磷酰胺治疗青春期前男孩可引起睾丸损伤、SSCs耗竭和曲细精管生殖指数(含精原细胞的管状截面百分比)降低[35-37]。回归分析表明，儿童急性白血病的治疗中，环磷酰胺当量剂量>4 000 mg/m2的儿童急性白血病治疗会导致精子发生障碍、精子耗竭和生育力下降[36-37]。Chow等[18]的研究提示，异环磷酰胺剂量超过25 000 mg/m2、丙卡嗪剂量超过3 000 mg/m2、顺铂剂量超过475 mg/m2的男性幸存者与未接触异环磷酰胺的人相比，致孕率和活产率显著降低。目前的普遍研究认为，累积剂量的化疗药物可直接破坏卵母细胞并导致卵泡耗竭，还可引起皮质纤维化和血管损伤。据推测，环磷酰胺暴露会激活PI3K信号通路，导致原始卵泡过早激活，从而导致卵泡池过早耗竭[38]。在青春期前接受化疗的ALL女性患儿中，有报道卵巢功能早衰发病率为10%[33]。而且随着累积剂量的增加，化疗药物对恶性肿瘤女性幸存者的性腺毒性风险增加，活产率降低，但就目前的化疗药物来说，暂时没有一个明确的致“不孕症”的安全剂量下限[18,22]。

表1 根据各种化疗药物的性腺毒性进行风险分类

3.3 放疗对性腺的毒性损害 放射治疗也与不孕症有关，因为卵巢和睾丸对辐射的有害影响都非常敏感，而且在相对低剂量下有可能导致永久性不育症。低剂量辐射可损害生精上皮，影响精原细胞，导致少精子症，而高剂量放射(>20 Gy)可进一步影响间质细胞，导致血清睾酮降低，血清促性腺激素升高[39]。在青春期前的男性患者中，给睾丸6 Gy的辐射剂量可导致永久性无精子症，而在成年男性患者中，这一阈值是2.5 Gy。研究表明，全身照射超过7.5 Gy会增加恶性肿瘤男童幸存者的不育率[6,34]。当卵巢直接处于辐射场中时，低剂量的辐射也会影响卵巢功能。在青春期前的女性患者中，>15 Gy的辐射剂量与不孕症有关，在青春期后以及成年女性中，阈值分别是>10 Gy和>6 Gy[34]。此外，青春期前子宫对放疗辐射也比成年子宫更敏感，有研究显示，放疗对6岁以下恶性肿瘤患儿的子宫损伤比卵巢严重[40]。

3.4 HSCT对生育功能的影响 HSCT会增加患者不育症的风险。一份来自欧洲7个儿童造血干细胞移植中心的344例患者的治疗和生育数据显示，儿童期接受HSCT的恶性肿瘤幸存者男、女性的不育症发生率分别为69%和83%[41]。HSCT治疗后约57%的青春期前/青春期儿童出现无青春期发育或发育停滞[42]。儿童期HSCT治疗后的女性恶性肿瘤幸存者出现进行性卵巢功能丧失和绝经期提前风险较大，仅有10%～14%的幸存者出现青春期发育和月经初潮，不到3%的HSCT幸存者能够怀孕，即使成功怀孕，还会面临流产、早产和低出生体重等不良危险因素[43]。一项关于儿童异基因造血干细胞移植后男性性腺功能的横断面研究显示，在98例研究对象中仅有31%的精液样本观察到精子[44]。移植后生育能力的恢复与移植前的处理方案有关，同时还可伴有急、慢性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)和长期免疫抑制剂的应用，进一步加重生育能力的损害。

4 生育力保存的防治策略

4.1 治疗方案的优化与选择 大多数情况下，细胞毒性治疗对精子发生和卵泡发育造成的损害是暂时的，少数导致不育。化疗产生的性腺毒性在很大程度上取决于所使用的药物组合和给予的药物累积剂量。烷化剂常与其他化疗药物联合使用，大大增加其生殖细胞毒性作用细胞毒性药物。MOPP疗法(氮芥、长春新碱、甲基苄肼、泼尼松)是霍奇金病的经典治疗方案，但有很高的致永久不育症风险。相比之下，另一种ABVD方案(阿霉素、博莱霉素、长春花碱、达卡巴嗪)致永久不育风险要小一些[45]。阿霉素(770 mg/m2)、长春新碱(8 g/m2)和长春花碱(50 g/m2)如果与强毒性药剂联合时可以起到附加作用，但是单独使用时只会引起暂时性的精子数量减少[46]。化疗药物的类别、放疗与否、手术方式和时机均会影响恶性肿瘤患儿的生育力，这些因素在治疗方案制定时就应该被纳入。

4.2 生殖细胞保护性药物的合理应用 有几种实验性和已建立的技术可用于保存恶性肿瘤儿童的生育能力。细胞保护剂可能在未来的生育保护策略中发挥重要作用。粒细胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)已被证明能显著减少环磷酰胺、白消安和顺铂对原始卵泡的破坏，动物实验证明可提高生育率。免疫调节剂AS101通过作用于PI3K/PTEN/Akt通路减少原始卵泡损伤，并且最新的研究表明AS101与环磷酰胺具有协同抗肿瘤活性。凋亡通路抑制剂鞘氨醇-1-磷酸(S1P)可作为放疗前的卵巢保护剂[47]。临床试验证实，促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)通过阻止原始卵泡的募集和发育成熟减少被细胞毒性药物暴露，但对人类卵巢作用的机制和效果尚不明确，而且该方法在青春期前的女性患儿这一人群中几乎没有应用的意义[48]。

4.3 生殖细胞的保存 美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology，ASCO)关于癌症患者生育能力保存的指南提出了几种适合肿瘤患者保持生殖功能的方法。比如生殖器官遮挡、GnRH-a等预防措施，以及生殖细胞冻存、睾丸/卵巢组织保持等治疗措施。该指南还指出，所有进入青春期并能在治疗开始前提供精液样本的男性患儿，都应将精子冷冻保存作为保留生育力的唯一手段。但据报告显示，精子冷冻在青少年恶性肿瘤男性患儿中的应用率不高，且冻存后的精子临床妊娠率只有23%～53%[34,49-50]。对于在青春期前无法产生精液样本的男性而言，可以选择睾丸组织冷冻保存(testicular tissue cryoprservation，TTC)，在适当的时侯进行自体移植完成完全的精子发生，有部分情况是睾丸细胞悬液中的SSCs数量少而需要进一步体外扩增。目前该技术仍处于实验阶段，在人类尚未得到证实，值得注意的是，在自体睾丸组织移植过程中，特别是对于白血病、NAL和转移性实体瘤的幸存者，有再次引入恶性肿瘤细胞的潜在风险[50-52]。对于女性肿瘤患者，胚胎冷冻保存是唯一被美国生殖学会(American Society for Reproductive Medicine，ASRM)认可的生育力保存方法，但显然该方法不适合儿童。成熟卵母细胞冻存需要卵巢刺激，同样不适用于青春期前的女孩。卵巢组织冷冻保存(ovarian cryopreservation，OTC)通过手术采取卵巢组织无时间限制，不耽误治疗，被认为是最具有可行性的生育力保存方法，但同样存在引入恶性细胞污染组织的可能[49,52-53]。生殖干细胞(germline stem cells，GSCs)具有多项分化潜能，可发育成成熟配子产生可育后代。该技术可为人类提供精子和卵母细胞的新来源，在肿瘤患者保存生育力或移植治疗不孕不育中有广阔前景。已有研究报道提出其他来源的干细胞，如人脐带间充质干细胞、人骨髓干细胞等对生育力恢复具有重要促进作用，有望成为生殖细胞耗竭无GSCs的恶性肿瘤患儿生育力保存的种子细胞[50-52]。

恶性肿瘤患儿的治疗重点从单纯地提高生存率到同时重视生育力保存，反映了我们在医学治疗方面的进步。对于儿童期特别是青春期前患儿来说，可选择的生育力保存方式是有限的，丧失生育能力进一步会导致心理问题，表现为社会适应困难、生活质量降低。因此，肿瘤生殖治疗是迫切且必要的。幸运的是，自体干细胞转分化而来的生殖细胞不仅携带有患者自身遗传基因，而且无瘤、纯化、避免污染，给睾丸/卵巢耗竭无生殖干细胞的患者带来了福音，是未来生育力保存发展的主要方向。

利益相关声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明：王曼娜执笔撰写，黄亮萍、谢丽春文献整理，陈运彬、马廉通信作者构思设计及指导论文撰写。