市售典型含油脂食品TBBQ含量分布研究

吕晓兰，余宁翔，叶 沁，吴泽仪，孟祥河

(浙江工业大学食品科学与工程学院1，德清 313200)(浙江省农业科学院食品科学研究所2，杭州 310014)

含油脂食品在生产、储藏过程中极易发生氧化反应从而影响食品品质，添加抗氧化剂是防止食品氧化的有效手段。特丁基对苯二酚(TBHQ)是含油脂食品中应用最广泛的抗氧化剂之一，其抗氧化效果在同等条件下优于其他抗氧化剂[1]。然而，TBHQ在食品生产和储藏过程中极易因氧化和挥发而损耗。Anwar等[2]在185 ℃加热、充氮条件下测定TBHQ降解产物，实验发现，TBHQ生成了30多种产物，而且加热时间越久，生成的产物越多。其中，特丁基对苯醌(TBBQ)是TBHQ最主要的转化产物[3]。相关毒理学研究表明，TBBQ的毒性远大于TBHQ。Braeuning等[4]分别用TBHQ和TBBQ处理老鼠中的3T3细胞，发现TBBQ用量只需TBHQ用量的1%，就能使相邻未经处理过的细胞死亡。RAW264.7细胞暴露于TBBQ后，通过剂量和时间依赖性方式调节细胞生长周期S/G2的转换，可抑制DNA的合成，从而诱导细胞凋亡[5]。Matsunaga等[6]也研究证实TBHQ对人体内皮细胞的毒性要小于TBBQ。虽然TBBQ的生物毒性机制尚未完全阐明，但这些研究成果证明TBBQ具有潜在的生物细胞毒性危害。

TBHQ是生成TBBQ的前体物质，所以食品中TBBQ的含量和食品中本身添加的TBHQ含量有关，而TBHQ转化生成TBBQ则和食品的加工工艺和储藏条件有关。之前的各项研究是在实验室条件下简单模拟食品的加工过程并测定食品中的TBBQ含量。但是在实际生产生活中，食品的加工程序复杂，不同食品的加工工艺不同，且食品的储藏运输条件不同，所以不同食品中TBBQ含量会因多种因素的影响而不同。目前关于含油脂食品中TBBQ含量分布的研究鲜有报道。同时，虽然国内外对TBHQ检测的研究已相当成熟，但对其代谢产物TBBQ的检测研究尚处于起步阶段，也没有专门的国家标准用来测定TBBQ。为了更好了解TBBQ在商业食品中的分布情况，以更准确的评估市售典型含油脂食品的健康风险，本实验在前人的研究基础上优化TBBQ检测的前处理方法，同时，根据国家标准中规定可添加TBHQ的食品分类，选取了118个样品，用优化后的前处理方法测定样品中TBBQ的含量，并讨论食品成分、加工工艺等对含油脂食品质量安全的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

叔丁基对苯醌(TBBQ)(≥98%)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、石油醚(分析纯)、精炼菜籽油。

BS124S型电子分析天平，Agilent1260液相色谱仪(紫外光度检测器)，TGL-10C型高速台式离心机，DE-400 g万能高速粉碎机，XH-B型漩涡振荡器，RE-2000A型旋转蒸发器，DKS-24型电热恒温水浴锅。

1.2 样品选择

按照GB 2760—2014中可添加TBHQ的食品分类，一共采集了六大类，118个样品：普通食用油、油炸面制品、腌制肉类、熟制坚果、烘焙食品、膨化食品均为市售，采购时间在2020年5月—2021年10月，所有样品均在保质期内，除部分腌制肉类中无法确定是否含TBHQ外，其他产品均确认添加了TBHQ。

1.3 食品中油样的提取

固体样品在高速粉碎机中粉碎，称取60 g于150 mL锥形瓶中。再加入50 mL的石油醚，振荡1 min，静置12 h后8 000 r/min下离心10 min。收集澄清液并用旋转蒸发器浓缩得到纯油。

1.4 油样中TBBQ的提取条件优化

称取1.00 g油样于5 mL离心管中，加入2 mL试剂(甲醇、乙腈、1∶1甲醇乙腈混合液)，剧烈振荡2 min，7 000～9 000 r/min离心1～5 min后，将上清液转移至5 mL容量瓶中。重复操作2次，每次加入1.5 mL试剂，合并上清液并定容。过0.45 μm的有机滤膜，进HPLC分析。

1.5 TBBQ检测

1.5.1 检测方法的建立

本实验采用HPLC法测定样品中TBBQ的含量，检测方法在前人的基础上进行了一些修改[7]。HPLC分析条件：色谱柱为Agilent XDB-C18(4.6×250 nm，2.5 μm)；在柱温为30 ℃的条件下用65%的甲醇和35%的纯水等度洗脱20 min，流速为0.80 mL/min；检测波长为254 nm；进样量为10 μL。通过比较样品的保留时间和标准品的保留时间，鉴定样品中的TBBQ。

1.5.2 方法的验证

定量样品中的TBBQ是通过比较待测样峰面积与标准曲线获得。该标准曲线是通过测定乙腈中TBBQ的连续稀释标准溶液(0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL)，分析TBBQ峰面积和浓度的相关性而建立的。线性回归方程为：Y=32.31X+7.643，其中R2=0.998。最低检出限为0.12 μg/mL，最低定量限为0.37 μg/mL。

1.5.3 回收率和相对标准偏差

通过加标回收实验选取最优的TBBQ检测前处理方法。回收实验以3种浓度的精炼菜籽油为实验对象。称取0.10 g TBBQ，溶于49.90 g精炼菜籽油中，配制成TBBQ含量为2 000.00 mg/kg的母液。分别称取5.00、1.00、0.05 g的母液，用油样稀释至40.00 g，制得TBBQ含量为250.00、50.00、2.50 mg/kg的储备用油。储备用油按1.4测定，精炼菜籽油的加标回收率为(90.15±0.45)%～(95.04±0.51)%，相对标准偏差为0.62%～0.76%。

1.6 数据处理与统计分析

所有实验至少重复2次及以上，数据采用单因素方差分析，所有数据均使用平均值±标准偏差(SD)表示。用SPSS16.0进行数据的显著性差异分析，P<0.05。用Origin8.5进行数据处理和作图。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

实验表明，最佳的提取溶剂是乙腈(图1a)，且TBBQ含量越高，提取效果越好，TBBQ的回收率在(89.87±0.68)%～(95.43±0.41)%。离心转速在7 000-9 000 r/min内时(图1b)，精炼菜籽油中TBBQ的回收率在(94.95±0.54)%～(95.43±0.41)%范围内波动，区别不大。离心时间在1～5 min内时(图1b)，精炼菜籽油中TBBQ的回收率在(94.11±1.02)%～(95.43±0.41)%范围内波动。

图1 精炼菜籽油中不同溶剂、提取溶剂用量(一次提取)、离心转速、离心时间对TBBQ回收率的影响

对于1.00 g的油脂而言，一次提取溶剂量为5 mL时(图1b)，提取效果最好，TBBQ的回收率为(95.95±0.87)%。最后确定TBBQ最优的前处理方法为：称取1.00 g油样于长试管中，用移液管移取加入2 mL乙腈(色谱级)。剧烈振荡2 min，8 000 r/min下离心3 min后，将上清液转移至5 mL容量瓶中。重复以上操作两次，每次加入1.5 mL的乙腈(色谱纯)，合并两次的上清液，定容至5 mL。

2.2 样品中TBBQ的测定结果

由表1可知，TBBQ的平均水平分布在(1.12±0.49)mg/kg至(4.16±4.99)mg/kg之间(表1)。在不同食品类别中，TBBQ的水平相对标准偏差均较高，TBBQ的SD在0.49～6.45 mg/kg之间。TBBQ含量最高的是瓜子，含量为(23.59±0.73)mg/kg。TBBQ平均含量最高的是膨化食品，平均值为(4.16±4.99)mg/kg。所有样本中，含量超过1.0、5.0、15.0 mg/kg的样品数分别占总样品数的53.39%、15.25%、3.39%。油炸面制品中TBBQ的检出率最高，为95.00%，腌制肉类中TBBQ的检出率最低，为37.50%。

表1 不同样品中TBBQ的含量分布

抽取的19个烘焙食品中(图2a)，TBBQ含量为0～(1.85±0.14)mg/kg。其中测得TBBQ含量最高的是一款沙琪玛，含量为(1.85±0.14)mg/kg。TBBQ的平均水平分布为(1.12±0.49)mg/kg。抽取的24个膨化食品中(图2b)，TBBQ含量分布区间为0～(17.29±0.53)mg/kg。其中测得TBBQ含量最高的产品是一款山药片，含量为(17.29±0.53)mg/kg。TBBQ的平均水平分布为(4.16±4.99)mg/kg。抽取的22个普通食用油中(图2c)，TBBQ含量分布区间为0～(2.76±0.13)mg/kg，TBBQ含量最高的是一款调和油，为(2.76±0.13)mg/kg。TBBQ的平均水平分布为(1.26±0.91)mg/kg。在抽取的样品中，大豆油和调和油中TBBQ含量普遍高于菜籽油，分析原因可能是不同油种类中本身添加的TBHQ量就不同。抽取的25个熟制坚果中(图2d)，TBBQ含量分布区间为0～(23.59±0.73)mg/kg。其中测得TBBQ含量最高的是瓜子，为(23.59±0.73)mg/kg。TBBQ的平均水平分布为(3.91±6.45)mg/kg。结果显示，水煮瓜子中TBBQ的含量是坚果中最高的，明显高于油炸坚果(如花生、荷兰豆)中TBBQ的含量，考虑是食品加工工艺的不同导致的区别。抽取的20个油炸面制品中(图2e)，TBBQ含量分布区间为0～(8.83±0.20)mg/kg。TBBQ的平均水平分布为(3.94±2.42)mg/kg。其中，一款辣条的TBBQ含量最高，为(8.83±0.20)mg/kg，普遍高于麻花中TBBQ的含量。抽取的8个腌制肉类中，TBBQ含量分布区间为(0.85±0.08)～(6.52±0.26)mg/kg，平均水平分布为(3.47±2.33)mg/kg。同时，实验发现腌制肉类的TBBQ检出率只有37.5%，虽然按照GB 2760—2014中可添加TBHQ的食品分类，TBHQ也能加入腌肉制品，但是在实际采购中发现，明确标明含有TBHQ的产品很少，究其原因，一是采用了其他抗氧化剂，如异抗坏血酸钠，二是因为腌肉制品中的水分含量和油含量均较低，从而降低了油氧化的风险，而且脂肪和油的部分氧化恰恰能形成腌肉制品独特的风味，这也限制了TBHQ的添加。

图2 烘焙食品、膨化食品、食用油、熟制坚果、油炸面制品TBBQ分布情况的箱型图

另外，实验发现118个样品中有53.39%样品中TBBQ含量大于1.0 mg/kg，有15.25%的样品TBBQ含量大于5.0 mg/kg，有3.39%的样品TBBQ 含量大于15.0 mg/kg。TBBQ有潜在细胞毒性，TBBQ浓度为1 μg/mL时会使老鼠前胃黏膜DNA断裂，5 μg/mL时，损伤肝细胞质膜[8，9]。Morimoto等[8]报道1% 3-BHA和0.001%TBHQ不会引起DNA的损伤，而0.0001%TBBQ就可引起DNA损伤，在相同浓度条件下，TBBQ对DNA的损伤高于TBHQ对DNA损伤的100倍以上。因此，将TBBQ列入风险因子来评估油脂食品的安全性是非常有必要的。

2.3 TBBQ含量分布与食品加工工艺的关系

大量研究表明，TBBQ在油脂储存过程中会伴随着TBHQ的损耗不断产生，是目前已知的TBHQ在加热条件下的主要转化产物[3]。所以TBBQ在食品中的含量分布与TBHQ的添加量紧密相连。TBHQ是合法的食品添加剂，国家规定允许最大的添加量是200 mg/kg。但在实际采样过程中发现，很多食用油及含油脂食品中其实并未添加TBHQ，而是采用添加其他抗氧化剂或使用其他抗氧化手段来达到抗氧化目的。而在添加TBHQ的食品中，TBBQ的含量又与TBHQ的添加方式、食品加工工艺有关。加热温度和时间会影响TBBQ的生成，而且，TBBQ会因挥发而损耗[10]。由此，本研究主要从TBHQ的添加方式和食品的加工方式(冷、热加工)来具体分析不同食品TBBQ含量分布与食品加工工艺的关系。

冷加工食品是指常温环境下，在食品加工过程中加入TBHQ，比如表面喷涂 TBHQ，以达到抗氧化的目的。在本课题采集到的样品中，辣条和腌肉制品属于冷加工食品。辣条的制作工艺是面筋做好后再添加TBHQ。腌制肉类的生产工艺是先腌制后风干，最后在表面喷涂TBHQ。散装腊肉中TBBQ含量较高(6.52±0.26)mg/kg。这个含量相较于其他类食品，TBBQ含量相对较高，分析原因可能是：一方面，油脂暴露于空气中容易氧化。Li等[11]通过加标回收实验发现，油脂在室温下储藏8周后TBBQ测定值比120 ℃下连续加热2～24 h后的TBBQ测定值都要高；另一方面，因为腌肉产品通常是用盐腌制，盐中含有的金属离子(如Cu2+、Fe3+等)会催化TBHQ转化生成TBBQ。

热加工可分为短时热加工和长时热加工。短时热加工主要是指短时的高温加工手段，常见的短时热加工产品有油炸类坚果、油炸型膨化食品等。长时热加工是指在长时高温下进行水煮或烘烤，常见的食品有饼干、蛋糕、瓜子花生和一些烘烤坚果等。

目前，食品工厂采用的短时煎炸条件大多数为：煎炸温度为120～200 ℃，每批次煎炸时长为30 s～3 min，与本课题组研究的煎炸模型接近[12]。在该模型中，TBHQ含量在第一次油炸后损失了30%～45%，随之而来的是 TBBQ含量的大幅提升。5～30 min内，样品分别在140、170、190 ℃条件下煎炸，140 ℃组测得的TBBQ最大含量比后2组测得的TBBQ最大含量高。2 h后，几乎检测不到TBBQ[12]。在本实验中，荷兰豆和花生的加工工艺就是短时油炸，这两者的TBBQ含量明显低于水煮瓜子。其中一种煎炸的荷兰豆没有检出TBBQ，与模型相符，推测该产品的加工工艺就是短时连续油炸。GB 17401—2003《膨化食品卫生标准》将膨化食品分为两大类：油炸型膨化食品和非油炸型膨化食品。本实验中山药片、玉米角、锅巴是油炸型膨化食品，米饼是非油炸型膨化食品。检测结果显示，山药片、玉米角和锅巴所含TBBQ的含量明显高于米饼。Buck[13]发现薯片在煎炸后，薯片的抗氧化能力提高同时油中的TBHQ含量下降，他由此推测 TBHQ 会在煎炸时被吸附到薯片中，从而提高薯片的抗氧化能力。膨化食品中TBBQ的平均水平分布为(4.16±4.99)mg/kg，高于其他类食品，分析原因可能一是由于膨化食品的加工模式是短时油炸，且煎炸油反复使用，符合之前团队研究的连续煎炸模型；二是因为膨化食品中的膨化剂会增大食品表面积和孔隙，使食品更容易接触水分和氧气，加速TBHQ向TBBQ转化。

烘烤坚果和水煮坚果的加工属于长时热加工。抽取的25个熟制坚果中，水煮瓜子中TBBQ的含量是几类坚果食品中最高的，最高为(23.59±0.73)mg/kg。水煮瓜子的加工工艺一般是在水煮过程中加入TBHQ，煮入味后干燥而成。在水煮过程中，为使调味料和TBHQ能渗入瓜子中产生作用，会在调味液中加入过量的调味料和TBHQ。这就导致瓜子在水煮和干燥过程时，TBHQ转化生成的TBBQ含量变多。另外，检测结果发现，品牌1瓜子中TBBQ 含量在(0.41±0.05)～(1.24±0.11)mg/kg，品牌2瓜子中 TBBQ 含量在(1.22±0.12)～(23.59±0.73)mg/kg。对比后发现，品牌1包装内添加了脱氧剂，且有独立密封袋，而品牌2则无。所以良好的产品包装能一定程度上防止TBHQ转化生成TBBQ。其次，检测结果还发现，不同口味的瓜子中所含TBBQ含量也不尽相同，总体来看，五香味瓜子中TBBQ含量小于其他口味的瓜子。分析原因可能是，瓜子在加工过程中，添加的某些物质(如花椒、八角)中所含的某些成分能阻止TBHQ向TBBQ转化[14]。而其他烘烤坚果，加工工艺一般是在高温或低温下烘烤，待食品冷却后再进行调味。油烘型坚果中TBHQ一般存在于油中，但是毕竟允许添加的TBHQ的含量有限，且在高温烘烤时也易挥发，限制了烘烤坚果中的TBHQ转化生成TBBQ。

烘焙食品也属于长时热加工产品。本次抽取的19个烘焙食品中TBBQ含量均低于(1.85±0.14)mg/kg，平均值为(1.12±0.49)mg/kg，低于其他五大类食品。从加工工艺分析，烘焙食品是将含有TBHQ的食用油与食品配料混合处理后进行烘烤。这种工艺的加热方式是在封闭环境下进行热风循环加热，这会加剧TBHQ氧化生成TBBQ。但是，TBBQ含量也只会在初始阶段快速增加，之后会因为缺乏前体物质以及自身的挥发而降低[5]。

3 结论

本实验通过加标回收实验得到TBBQ检测的最优前处理条件为：萃取试剂为乙腈、8 000 r/min离心3 min、一次提取溶剂量为5 mL。同时，统计分析了118个市售典型含油脂食品中TBBQ的含量分布情况。测定结果显示，所有样品TBBQ的平均水平分布在(1.12±0.49)～(4.16±4.99)mg/kg之间，整体趋势如下：膨化食品>油炸面制品>熟制坚果>腌制肉类>食用油>烘焙食品。不同食品中TBBQ的含量和初始TBHQ的添加量及食品加工工艺有关。腌制肉类中TBBQ的检出率最低，只有37.5%，油炸面制品的检出率最高，为95%。所有食品中，水煮瓜子的TBBQ含量明显高于其他类食品，其中五香味瓜子的TBBQ含量低于其他口味瓜子。