河池市小反刍兽疫免疫抗体和病原监测报告

韦喜梅 徐 勒 刘杰标

广西河池市动物疫病预防控制中心，广西河池 547000

小反刍兽疫又叫小反刍兽瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的高度接触性动物传染病，发病率和病死率可高达100%。该病的临诊表现与牛瘟相似，故也被称为伪牛瘟，其特征是发病急剧、高热稽留、眼鼻分泌物增加、口腔糜烂、腹泻和肺炎，主要感染绵羊和山羊，危害相当严重。本病被OIE 列入A 类动物疫病，该病是世界动物卫生组织（OIE）必须通报的动物疫病，也是全球计划根除的动物疫病，在我国被列为一类动物疫病[1]。2007年，小反刍兽疫首次传入我国西藏阿里地区，但被迅速控制，未发生扩散[2]；2013年11月底，小反刍兽疫再次传入我国并波及多个省份。近几年来，河池市11个县（区）从全国各地引进各种品种的羊以及羊的饲养量的增加，使发生小反刍兽疫风险升高，从2015年起河池市对羊群开始进行小反刍兽疫强制免疫。为掌握全市小反刍兽疫免疫抗体和感染情况，科学评估免疫效果，评估小反刍兽疫发生的风险，为指导河池市小反刍兽疫防控提供科学依据，从2015年开始进行小反刍兽疫免疫效果和病原监测，现把河池市近4年小反刍兽疫血清学和病原学监测情况报告如下。

1 样品与检测方法

1.1 样品采集

样品主要来自全市11 个县（区）定点监测与日常监测，每年春秋两防检查采集，采样时详细填写采样单，标明采样地点、采样时间、免疫时间、疫苗生产企业等信息。

1.2 检测方法

1）血清学检测。采用阻断ELISA 方法检测免疫抗体水平，采用试剂盒厂家是青岛立见诊断技术发展中心，操作方法如下：①在包被板上设2 个阴性孔加入50 μL 阴性血清，2 个阳性孔加入50 μL 阳性血清，2 个空白对照孔，加入50 μL 稀释液，剩余孔加入25 μL 样品稀释液，然后加入25 μL 样品用于检测；②轻轻摇匀孔中样品，在37 ℃恒温箱孵育60 min；③甩干包被板孔中的液体，每孔加入300 μL 洗涤液，洗涤4 次，拍干；④每孔加入50 μL酶标抗体，在37 ℃恒温箱30 min；⑤甩干包被板孔中的液体，每孔加入300 μL 工作浓度的洗涤液，洗涤4 次，拍干；⑥每孔加入50 μL 底物溶液，室温下避光孵育15 min；⑦使用酶标仪测定450 nm 波长处的OD 值。

结果判定：阳性血清阻断率=100-阳性OD 平均值/空白OD 平均值×100；阴性血清阻断率=100-阴性OD 平均值/空白OD 平均值×100；样品阻断率=100-样品OD 值/空白OD 平均值×100。

试验成立条件：根据阻断率判定检验结果：阳性阻断率＞60，阴性阻断率＜40，试验结果有效，否则重新进行试验。判定：样品阻断率＞50，结果为阳性；样品阻断率＜50，结果为阴性。

2）病原学检测。采用RT-PCR 方法检测病毒核酸，选用的试剂盒为北京世纪元亨动物防疫技术有限公司小反刍兽疫RT-PCR 检测试剂盒，操作步骤如下：

①病毒RNA 的提取：取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600 μL，充分颠倒混匀，室温静置3～5 min；将液体吸入吸附柱中，13 000 r/min 离心30 s；弃去收集管中液体，加入600 μL 洗液，13 000 r/min 离心30 s，再重复1 次；弃去收集管中液体，13 000 r/min 空柱离心2 min，以除去残留的洗涤液；将吸附柱移入新的1.5 mL 离心管中，向柱中央加入洗脱液50 μL，室温静置1 min，13 000 r/min 离心30 s，离心管中液体即为模板RNA。

②RT-PCR 扩增。每份总体积20 μL，含16.8 μL RT-PCR 反应液（用前混匀），1.2 μL 酶混合液，2 μL 模板RNA。在PCR 扩增仪上进行以下程序：42 ℃45 min，94 ℃3 min；循环94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 次，再72 ℃延伸7 min。

③电泳。称琼脂糖1.5 g 置于500 mL 锥形瓶中，加入200 mL 50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液，放在微波炉中溶解，再加入10 μL 染色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR 扩增产物10 μL 和上样缓冲液2 μL 混合，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120 V 电压与50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳，在成像系统观察结果。

④结果判定。阳性对照出现350 bp 扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，试验结果成立。检测样品出现350 bp 扩增带判断为小反刍兽疫病毒阳性，否则判为阴性。

2 结 果

2.1 总体情况

2017-2020年共检测12 094 份血清，其中抗体合格样品11 013 份，合格率为91.1%，已达到国家要求的70%以上的标准。病原学检测样品为3 770份，结果均为阴性（表1）。

表1 2017-2020年小反刍兽疫免疫抗体和病原检测情况

2.2 不同年份的总体情况

2017-2020年抗体检测数分别为2 804、3 195、3 084、2 681 份，抗体合格数分别为2 359、2 889、3 084、2 681 份，合格率分别为84.1%、90.4%、93.8%、95.5%。4年均达到农业农村部规定的70%以上的要求；病原学检测数分别为1 095、1 139、886、650 份，结果均为阴性。

2.3 规模场与散养户的总体情况

规模场检测的样品总数为8 537 份，合格数为7 959 份，合格率为93.2%；散养户检测样品总数为3 557 份，合格数为3 054 份，合格率为85.9%。

2.4 不同县区的情况

2017-2020年在全市的11 个县区小反刍兽疫免疫抗体合格率，除2017年有一个县合格率为68%，低于国家标准外，其余地区均达到国家标准（在70%以上）。不同县区合格率会有所区别，但区别不大，都是逐年呈递增；病原学检测中无阳性（表2）。

表2 2017-2020年不同县区血清学和病原学检测情况

3 结 论

1）从监测结果看，河池市小反刍兽疫免疫抗体合格率连续4年均达到农业农村部规定的70%以上的要求，小反刍兽疫病原连续4年监测结果均为阴性，表明河池市发生小反刍兽疫风险低。

2）河池市小反刍疫免疫抗体的合格率连续4年均达到农业农村部规定的70%以上的要求，由此可见养殖户对于小反刍兽疫免疫越来越重视，认识到防疫措施的重要性，以防为主，以治为辅。

3）从规模场和散养户免疫抗体监测结果看，规模场和散养户免疫抗体的合格率都比较高，说明规模养殖户和散养户对于防疫都比较重视，认识到要防止小反刍疫的发生，防疫措施必须做得到位，以减少疫病的发生，减少成本，增加经济效益。

4）虽然河池市2017-2020年小反刍兽疫免疫抗体合格率都达农业农村部规定的70%以上的要求，病原监测结果均为阴性，但是随着河池市大量发展牛羊的产业，从外地引进的羊只也会大量的增长，仍有感染小反刍兽疫的风险，应加强调运监管、落实强制免疫、监测与流行病调查等防控措施，强化养殖、交易、屠宰等责任，提高河池市整体防控的能力，开展培训班让养殖户了解其中的危害，加强防控意识，特别是散养户，本身的意识薄弱，因此要提高他们的防控意识，从而提高养殖技术，降低成本，提高收入，为乡村振兴助力。