缢蛏糖原磷酸化酶基因多态性与糖原含量的关联分析

陈燕园 ，林志华 ，刘圣，姚韩韩，董迎辉

(1.浙江万里学院 生物与环境学院 浙江省水产种质资源高效利用技术研究重点实验室，浙江 宁波 315100；2.上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306；3.浙江万里学院 宁海海洋生物种业研究院，浙江 宁海 315604)

1 引言

糖原是储存于动物肝脏、肌肉中的支链多糖，是一种易于储存、随时可用的葡萄糖储备[1]。糖原的存在既保证了机体的正常运行，又对维持能量动态平衡起着至关重要的作用。在海洋双壳贝类中，有些种类的糖原储存于特定囊泡细胞中，其含量的变化与配子发育、生长、繁殖、抗逆、风味等密切相关[2]。在滑项薄壳鸟蛤（Fulvia mutica）[3]、魁蚶（Scapharca broughtonii）[4]、缢蛏（Sinonovacula constricta）[5]等多种贝类的研究中发现，性腺成熟过程中糖原含量显著下降；在夏季不利的环境中，糖原含量高的贝类抵抗能力强、死亡率低[6]；在长牡蛎（Crassostrea gigas）[7]、缢蛏[8]中，高糖原含量能显著增加肉质的鲜味和口感。

糖原磷酸化酶（Glycogen Phosphorylase，GPH）是糖原分解过程中的关键酶，催化糖原的磷酸解反应[9]。GPH基因最早在家兔肌肉中发现，随后获得糖原磷酸化酶基因的cDNA 序列[10-11]。在海水贝类中，已克隆获得长牡蛎和福建牡蛎（Crassostrea angulata）GPH基因的cDNA 全长序列，并发现GPH基因表达水平与糖原含量变化有关[12-13]。此外，在长牡蛎GPH基因中筛查到了1 个与糖原含量关联的SNP 位点[14]。目前，尚未见对缢蛏糖原磷酸化酶基因的相关研究。

缢蛏广泛分布于我国沿海滩涂，是浙江、福建等省份的主养贝类[15]。不同季节缢蛏的营养物质、鲜味变化很大，一般春季3-6 月最佳，与其糖原含量密切相关[16]，然而目前有关缢蛏糖原调控的分子机制尚不明晰。本研究克隆了缢蛏糖原磷酸化酶基因（Sc-GPH）cDNA 全长，分析其在缢蛏不同组织和月份的表达水平，并筛选与糖原含量相关的SNP 位点，为高糖原缢蛏的分子育种提供候选基因和标记。

2 材料与方法

2.1 实验材料

以浙江宏野海产品有限公司养殖的缢蛏“甬乐1 号”为材料，自2019 年2 月开始采集缢蛏样品（16 月龄，壳长为（61.63±3.69）mm，壳宽为（15.28±2.35）mm，壳高为（19.53±2.26）mm，体重为（14.08±2.11）g），此后每两个月定时采样，样品均为同一批，直至12 月采样结束。每次取样，随机选取12 颗缢蛏，活体解剖取8 个组织（足、外套膜、性腺、闭壳肌、肝胰腺、水管、鳃和唇瓣），经液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于糖原含量测定和RNA 提取。

用于SNP 分析的缢蛏群体分别为“甬乐1 号”（YL1）和台州市野生群体（TZ），各取100 颗个体的足肌，一部分用于RNA 提取，一部分经真空冷冻干燥置于-20℃保存，用于糖原含量测定。

2.2 糖原含量分析

取缢蛏不同组织、不同月份及不同群体样品，按照南京建成生物研究所生产的肝/肌糖原检测试剂盒（A043）的说明书进行糖原含量的测定。冻干样品中加入碱液，100°C 加热20 min 进行皂化。冷却后，加入蒽酮-硫酸溶液进行反应后，在Spark 多功能酶标仪（TECAN，瑞士）620 nm 波长处测定吸光度。

2.3 Sc-GPH cDNA 全长克隆

根据缢蛏转录组文库中获得的Sc-GPH转录本序列，设 计3′-RACE 和5′-RACE 特异性引物（表1）。以成贝足中总RNA 为模板，用SMART RACE 5′/3′试剂盒（Clontech，美国）合成cDNA 第一条链。以cDNA第一链为模板进行3′-RACE和5′-RACE 扩增，其产物用1%琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化后的PCR 产物与pEASY®-T1 克隆载体（全式金，北京）进行连接，接着转化到DH5α 感受态细胞（全式金，北京）中，挑选阳性菌落送上海生工公司进行测序。

表1 所用的引物及信息Table 1 The information of primers used in this experiment

2.4 Sc-GPH 序列及系统进化分析

利用DNAMAN 6.6 软件将所获得Sc-GPH的5′-RACE 和3′-RACE 片段序列与转录本拼接，获得cDNA 全长；通过ORF Finder 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测基因的开放阅读框（OpeanReading Frame,ORF）及氨基酸序列；利用Expasy（https://web.expasy.org/compute_pi/）预测蛋白质的分子量和等电点、Signalp（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽；用Smart（http://smart embl-heidelberg.de/）预测功能域；通过BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）在线工具对Sc-GPH所编码的氨基酸序列进行相似性分析，并用DNAMAN 6.6 软件进行多重序列比对；用MEGA 6.0 软件邻接法构建系统进化树。

2.5 实时荧光定量PCR 分析

将缢蛏8 个组织和不同月份缢蛏足、外套膜的cDNA 稀释50 倍作为模板，用18S rDNA 基因作为内参基因，利用LightCycler®480（Roche，德国）荧光定量PCR仪进行实时定量PCR。反应体系（20μL）：2×SYBR GreenⅠMaster（Roche，德国）10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 6 μL；反应程序：95°C 预变性10 min，然后95°C 10 s、60°C 1 min，45 个循环。为了保证荧光定量PCR 的可靠性，每个样品做3 个技术重复，每组做4 个生物学重复，Sc-GPH的相对表达量按照2-ΔΔct法计算，并用平均值±标准差表示。数据通过SPSS 22.0 软件进行方差分析，p＜0.05为差异显著，p＜0.01 为差异极显著。

2.6 糖原含量相关SNP 的筛选

取缢蛏“甬乐1 号”（YL1）和台州市野生群体（TZ）2 个群体各100 颗的足肌，提取RNA 并反转录合成cDNA。根据Sc-GPHcDNA 序列，用Primer Premier 5软件设计引物H-S-F 和H-S-R（表1），PCR 扩增产物进行Sanger 测序。使用MEGA 6.0 软件进行序列比对，运用SPSS 22.0 软件将得到SNP 位点的基因型值与基因型值对应的糖原含量进行线性回归分析，将其中一种等位基因纯合子赋值为2，另一种等位基因纯合子基因型值赋值为0，杂合子赋值为1[17]。

3 结果

3.1 缢蛏糖原含量的组织差异和月份变化分析

取浙江缢蛏软体部糖原含量最高的4 月份样品[17]的不同组织（鳃、闭壳肌、足、外套膜、肝胰腺、性腺、水管、唇瓣），用于糖原含量组织差异分析。结果显示，足和外套膜糖原含量分别为（103.1±8.3）mg/g 和（111.0±10.5）mg/g，极显著高于除闭壳肌外的其他组织（p＜0.01，图1A）。缢蛏足和外套膜周年的糖原含量测定结果表明，上半年的糖原含量显著高于下半年，从2 月份逐渐增加，4 月份达到峰值，足和外套膜糖原含量分别为（141.3±9.8）mg/g 和（148.3±4.7）mg/g（p＜0.01），随后逐渐下降至10 月份的最低值，足和外套膜糖原含量分别为（13.0±1.2）mg/g 和（15.3±1.6）mg/g（图1B）。

图1 缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的糖原含量变化Fig.1 Changes of glycogen content in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B) of Sinonovacula constricta

3.2 Sc-GPH 全长cDNA 序列分析

Sc-GPHcDNA 全长3 963 bp（GenBank 登录号：MT125681），包括5′非编码区（Untranslated Region，UTR）112 bp、3′UTR 1 310 bp、开放阅读框2 541 bp，共编码846 个氨基酸。预测其蛋白分子质量（Mw）为97.23 kDa，理论等电点（pI）为6.11；该蛋白质的氨基酸组成中，极性氨基酸所占比例较高，表现为亲水性，没有明显的信号肽；预测Sc-GPH 蛋白在113～828 aa含有1 个功能域，为Phosphorylase。

选取16 种动物GPH 氨基酸序列与Sc-GPH 氨基酸序列作多重比对。结果发现，Sc-GPH 与虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis，OWF50424.1）、欧洲大扇贝（Pecten maximus，XP_033734012.1）、长牡蛎（Crassostrea gigas，CCN27372.1）GPH 的氨基酸序列相似性较高，分别为78.34%、78.11%和77.87%，与日本对虾（Penaeus japonicus，BAJ23879.1）、家蚕（Bombyx mori，ACB41088.1）、智人（Homo sapiens，NP_059125.2）等物种的相似性为70.45%～75.86%。系统进化树结果显示，缢蛏与欧洲大扇贝、虾夷扇贝、长牡蛎等贝类亲缘关系较近，聚为一支；与昆虫类、甲壳类、哺乳动物类亲缘关系较远（图2）。

图2 缢蛏与其他物种GPH 氨基酸序列系统进化分析Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of GPH among Sinonovacula constricta and other species

3.3 不同组织、不同月份Sc-GPH 的表达模式

取8 月份缢蛏的不同组织样品，利用qRT-PCR 检测Sc-GPH的组织表达特征，结果显示，Sc-GPH在8 个组织均有表达，其中足、外套膜的表达量最高（p＜0.01，图3A）。Sc-GPH在缢蛏不同月份外套膜和足的表达结果表明，Sc-GPH在8 月的表达水平极显著高于其他月份（p＜0.01，图3B）。

图3 Sc-GPH 在缢蛏不同组织（A）和不同月份足和外套膜（B）的的表达特征Fig.3 The expression characteristics of Sc-GPH in different tissues (A) and different months in foot and mantle (B)

3.4 Sc-GPH SNP 位点与糖原含量的关联分析

在缢蛏YL1 群体中，Sc-GPH编码区域共发现33 个SNP 位点，其中4 个位点（c.874C＞T、c.930T＞C、c.1133T＞C、c.1284T＞A）与糖原含量的相关性较为显著，c.1133T＞C、c.1284T＞A 位点差异显著（p＜0.05，表2）；在TZ 群体同样筛选到c.930T＞C 位点（表2），且该位点为同义突变。在缢蛏两个群体中，c.930T＞C 位点与糖原含量相关性均为差异显著（p＜0.05，表2），CC 基因型个体的糖原含量比TT 基因型的个体高（p＜0.05），说明该位点与缢蛏糖原含量相关。

表2 缢蛏“甬乐1 号”（YL1）和台州野生群体（TZ）Sc-GPH SNPs 位点与糖原含量的相关性分析Table 2 Association of SNPs of Sc-GPH with glycogen content in YL1 and TZ of Sinonovacula constricta

4 讨论

糖原是一种可以直接利用的储能物质，包括储存于肌肉中的肌糖原和肝脏中的肝糖原。在哺乳动物中，骨骼肌中的肌糖原占身体糖原总量的2/3，肝脏中的肝糖原占糖原总量的1/3。研究发现，不同海洋贝类贮存糖原的部位不尽相同，如长牡蛎的糖原主要贮存于性腺、唇瓣中[12]，紫贻贝（Mytilus edulis）的糖原则贮存在外套膜中[18]，而墨西哥湾扇贝（Argopecten irradians concentricus）的糖原贮存在闭壳肌中，并因繁殖周期、环境而发生变化[19]。本研究发现，缢蛏足和外套膜组织的糖原含量高于其他组织，与Yan 等[20]的研究结果基本一致，说明这两个组织是缢蛏糖原的主要贮存部位，它们具有较高的肌肉含量，肌糖原分解可为其收缩供给充足能量。另外，在缢蛏肝胰腺中亦有较高的糖原含量，推测主要存在于肝细胞中的肝糖原，其分解可以维持血糖浓度的恒定，从而保证机体的正常生理功能。

糖原代谢的多个调节过程，如葡萄糖的增加和糖原降解的减少，均可能由糖原磷酸化酶引起[21]。研究表明，糖原磷酸化酶激活催化糖原水解为葡萄糖，导致GPH基因表达量增加，从而为机体提供能量[22-23]。此外，GPH基因在不同发育时期和组织中均有表达，但表达量存在明显差异，如福建牡蛎GPH基因在性腺和闭壳肌中表达量较高[13]。本研究结果表明，在缢蛏8 个组织中均检测到Sc-GPH的表达，其中足和外套膜呈现高表达，与其对应的高糖原含量及其存储糖原能力有关。在许多物种中发现，肌肉是活性糖原的储存库，以便快速提供ATP[24]。2-5 月为缢蛏性腺发育的休止期，糖原含量较高，与此同时检测到Sc-GPH在足和外套膜中低表达，说明缢蛏体内正在合成储存糖原；随着配子的发生，Sc-GPH的表达量显著增加，而糖原含量降低，表明糖原储存向糖原分解转变。因此，Sc-GPHmRNA 表达水平的变化与缢蛏繁殖周期关系紧密，其在配子发生期间可利用足和外套膜中的糖原。

多数SNP 位于基因组的非编码区，在群体遗传和生物进化研究中起着重要作用[25-26]，而编码区的SNP 位点则具有较高的遗传稳定性[27]。本实验在缢蛏Sc-GPH的编码区共检测到个33 个SNP 位点，SNP 平均密度达到1/72 bp，这与缢蛏生长因子受体结合蛋白2 基因外显子上 SNP 平均密度（1/65 bp）[28]、长牡蛎糖原磷酸化酶基因外显子SNP 平均密度（1/35 bp）[29]等存在差异，说明同一物种不同基因或不同物种之间SNP 分布密度不同。在缢蛏Sc-GPH与糖原含量的关联分析中发现，1 个SNP 位点与糖原含量相关，c.930T＞C 位点的CC 基因型个体的糖原含量比TT 基因型的个体高，该位点可作为缢蛏高糖原遗传育种的重要候选分子标记。