小麦籽粒不同部位蛋白质形貌与流变特性

代美瑶，张影全，潘伟春，张 波*，郭波莉

（1 中国农业科学院农产品加工研究所 农业农村部农产品加工重点实验室 北京 100193 2 浙江工商大学 杭州 310018）

小麦是重要的粮食作物，约70%用于制粉。面粉制成的面制品是人们摄取能量和蛋白质的主要来源，是我国北方居民的主食。制粉是反复破碎、筛理，将皮层和胚芽从籽粒中分离出去，获得胚乳（面粉）的过程。根据破碎和筛理顺序，可以得到籽粒不同部位的面粉，俗称前路粉、中路粉和后路粉。一般而言，前路粉为靠近籽粒中心的胚乳，后路粉则为靠近籽粒外围皮层的胚乳。不同部位胚乳所含蛋白质的理化特性不同，所制成的面制品质量也不同。研究籽粒不同部位蛋白质的理化特性，可为面粉质量控制和专用粉生产提供帮助。小麦籽粒由胚乳（82.7%～83.7%）、皮层（13.1%～14.3%）和胚（3%）组成[1]。蛋白质和淀粉是小麦籽粒的主要组成成分，二者分别占成熟小麦籽粒重的9%～15%和65%～70%，其含量和组成决定了小麦籽粒的品质和最终加工用途[2]。蛋白质中80%是面筋蛋白，其为面团提供独特的黏弹性，使小麦面粉适用于生产品种多样的面制品，如面包和面条等[3]。不溶于十二烷基硫酸钠溶液（Sodium dodecyl sulfate，SDS） 的蛋白质被称为谷蛋白大聚体（Glutenin macropolymer，GMP），其含量与面团流变学特性密切相关[4]。小麦籽粒不同部位的蛋白质[5]分布是不均匀的。王晓曦等[6]发现，蛋白质在越接近籽粒中心处含量越低，质量却很好，越接近皮层处含量越高，而质量较差。Zhong 等[7]在研究氮肥追肥时间对小麦籽粒不同部位蛋白质的空间分布和质量性状的影响时，发现粗蛋白、干面筋和谷蛋白大聚体的含量越接近胚乳中心越低。Wang 等[8]研究粉路中蛋白质组分的分布及其与面包品质的关系时，发现粗蛋白含量也呈现类似的分布趋势。Liu 等[9]研究粉路中的硫、蛋白质大小分布和游离氨基酸及其与面团流变学和面包制作特性的关系时，发现越靠近小麦籽粒胚乳中心，SDS 可溶和SDS 不可溶蛋白在面粉中的占比越高。Pojic等[10]采用化学计量学方法表征粉路粉的化学和流变性质时，发现蛋白质、湿面筋和干面筋均呈现先增加后降低的变化趋势。Banu 等[11]用工业磨制备样品，检测各粉路面粉理化特性和面团流变特性，结果表明，皮磨系统和心磨系统的粗蛋白和湿面筋含量从籽粒中心到外围总体上呈直线上升趋势，然而面筋指数各粉路之间差异并不显著。可见，蛋白质及其组分含量在籽粒中的分布已基本清晰，而籽粒中心面粉质量好的原因仍不清楚。本试验以同一批小麦籽粒为试验材料，分别使用碾米机、三皮三心实验磨和六皮八心磨粉机对应制备7 份逐层碾磨粉，8 份三皮三心粉路粉和36 份六皮八心粉路粉，采用亮度值（L*）与灰分的比值定量表征籽粒的部位，在检测参试粉的粗蛋白、干面筋、谷蛋白大聚体（十二烷基硫酸钠不溶性蛋白）等蛋白组分含量以及面筋持水率、十二烷基硫酸钠溶剂保持力等指标的基础上，重点研究参试粉十二烷基硫酸钠可溶蛋白的形貌和谷蛋白大聚体动态流变学特性，旨在探究籽粒不同部位蛋白质形貌和流变特性的差异，为解释磨制所得不同粉路粉制作面制品存在质量差异的原因提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用同一批师栾02-1 小麦品种，河北金沙河面业集团有限责任公司2018年提供。逐层碾磨粉、三皮三心粉路粉，2018～2019年在中国农业科学院农产品加工研究所制备。六皮八心粉路粉，2018年在河北某企业制备。

1.2 设备与仪器

TM05-C 型碾米机，日本SATAKE 公司；MLU 220 型实验磨，中国布勒机械制造有限公司；3-30K 型台式高速冷冻离心机，德国SIGMA 公司；Thermomixer comfort 型恒温混匀仪，德国EPPENDORF 公司；Vortex-Genie 2 型漩涡振荡器，美国SCIENTIFIC INDUSTRIES 公司；ALPHA1-2LDPLUS 型真空冷冻干燥机，德国CHRIST 公司；DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱，中国精宏实验设备有限公司；CR-400/410 型色彩色差计，日本PROCHEM PACIFIC 公司；DN2100 型杜马斯定氮仪，北京诺德泰科公司；Glutork2020 型电加热干燥器、CF 2015 型面筋指数仪，瑞典Perten 公司；La Chrom 型高效液相系统，日本Hitachi High Technologies 公司；DAWN Heleos-Ⅱ型多角度激光检测器、Optilab 型示差检测器，美国Wyatt Technologies 公司；MCR502 型流变仪，奥地利Anton Paar 公司。

1.3 方法

1.3.1 参试粉的制备

1） 逐层碾磨粉的制备 参考Tosi 等[12]的方法，采用碾米机制备。用8 目不锈钢筛网挑选均匀饱满的小麦籽粒。将200 g 籽粒逐层碾磨出6 个样品，质量约占籽粒质量的7%，6%，7%，10%，10%，10%，分别对应于富含果皮组织、糊粉层、亚糊粉层和3 个逐渐靠近中心的胚乳，位置编号分别为1，2，3，4，5，6。约占粒重50%的剩余核心部位由于颗粒较小，无法使用碾米机制备，故采用实验磨粉机磨制，位置编号为7，代表最接近中心的胚乳。

2） 三皮三心粉路粉的制备 将小麦籽粒水分调节至15%，并用实验磨粉机进行磨粉，分别获得皮磨粉（B1，B2，B3）、心磨粉（R1，R2，R3）、细麸和粗麸，按照籽粒从外到内的顺序编号，分别对应位置编号1～8，如表1所示。

3） 六皮八心磨粉机样品的制备 使用某企业车间六皮八心磨粉机进行制粉，组织多人在相同时间内收集各个粉路的面粉。对相近的粉路粉根据其流量进行配比得到36 个面粉样品：皮磨粉1B、2B、3B、3BF、4B、4BF、5B、5BF、6BF；重筛粉D1、D2、D3、D4、D5、DS；打麸粉DF；渣磨粉1S、2S；心磨粉1M1、1M2、1M3、2M1、2M2、3M1、3M2、4M1、4M2、5M1、5M2、6M1、6M2、7M、8M；尾磨粉1T、2T；吸风粉XF4。按照从外到内的部位，编制位置编号，根据制粉师的经验，来源于籽粒相近部位的面粉将编制相同的位置编号，36 个面粉分别编入1～14 的位置编号，如表1所示。

表1 三皮三心粉路粉和六皮八心粉路粉与对应的位置编号Table 1 Correspondence between flour mill streams by experimental mill and industrial mill to position number

由于位置编号1 和2 的参试粉中麸皮含量较高，基本不含面筋，并且其戊聚糖含量较高，对GMP 组成和动态流变性质将产生影响[13]，故只选择位置编号3～7 的逐层碾磨粉，编号3～8 的三皮三心粉和编号3～14 的六皮八心粉等参试粉进行研究。

1.3.2 色值的检测 采用色彩色差计检测，采用Lab 色空间，用L*、a*和b*等值表示。L*是亮度值，0 代表黑色，100 代表白色。a*是红绿值，b*是黄蓝值。每个参试粉平行测试3 次。

1.3.3 灰分、粗蛋白、干面筋含量检测和面筋持水率的计算 参照AACC 方法08-01.01 测定灰分含量[14]。粗蛋白含量测定：参考ISO/TS16634-2：2016 中所述的Dumas 燃烧方法[15]，以天冬氨酸为标准，用杜马斯定氮仪检测，换算系数为5.7。湿面筋参照AACC 方法38-10.01 制备[16]。干面筋含量测定：参照ISO 21415-3：2006[17]和ISO 21415-4：2006[18]。采用式（1）计算面筋持水率。

1.3.4 SDS 可溶蛋白、GMP 含量检测和SDS 溶剂保持力的计算 参照Don 等[19]的方法，称取1.4 g样品放入50 mL 离心管（m1）内，旋涡振荡，同时加入超纯水23.8 mL，平均分2 次加入，振荡至样品完全分散在水中。加入4.2 mL 的10%SDS 溶液，盖紧瓶盖后手动缓慢上下颠倒，充分混匀。于20℃，20 000×g 离心30 min。缓慢倒出上清液，倒扣离心管10 s 后称重并记录上清液质量（m2）、离心管和沉淀质量（m3）。取1 mL 上清液（m4），在50℃下干燥48 h（m5），利用杜马斯定氮仪分析SDS可溶蛋白质量分数（C）。采用式（2）和式（3）进行计算蛋白质质量分数（w1）[20]，采用式（4）计算SDS 溶剂保持力（SRC），以质量分数计，数值以%表示。

式中，w1——单位质量组分中SDS 可溶蛋白质量分数 （mg/g）；w2——单位质量组分粗蛋白质量分数 （mg/g）；m1——空离心管质量（g）；m2——上清液总质量 （g）；m3——离心管和离心后小麦GMP 凝胶的总质量 （g）；m4——1 mL 上清液的质量（g）；m5——1 mL 上清液干燥后的质量（g）；C——各组分蛋白质质量分数（%）；1.40——公式（2）中各组分样品的质量（g）；1.40——公式（4）中试样质量（g）；14——将溶剂保持力转换成14%湿基标准的水分含量；T1——试样的水分质量（g）。

1.3.5 蛋白质形貌特征分析 SDS 可溶性蛋白形貌特征参考Fang 等[21]的方法，采用尺寸排阻色谱（SEC）和多角度激光散射（MALLS）联用技术进行十八角度激光光散射仪检测。十八角度激光光散射仪配备La Chrom 型高效液相系统：Hitachi L-2130 泵和Hitachi L-2400 紫外检测器。检测器工作波长为280 nm。色谱柱：TSK G4000 SWXL，规格7.8 mm×300 mm，柱温25 ℃。流动相：0.1%-50 mmol/L 磷酸缓冲液，流速0.5 mL/min，使用前先超声30 min，再用0.2 μm 的滤膜过滤。DAWN Heleos-Ⅱ激光检测器：检测波长658 nm，工作温度25 ℃；Optilab 型示差检测器：特定示差折光增量（dn/dc）0.185 mL/g；进样量200 μL。

检测结果分为激光信号、示差信号和紫外信号，标样牛血清白蛋白的洗脱图如图1所示。采用系统自带的ASTRA 软件分析，可得到样品的Mw、Mn和Rgz等指标。Mw是指样品的重均摩尔质量。Rgz是指样品的z-均回转半径，用于描述粒子形状的大小[21-22]。MW/Rgz3表示样品粒子的紧密度，比值越大，越致密。Mw/Mn为多分散系数，用于表征样品粒子摩尔质量的分布，该值越接近1，样品越均匀；该值越大，分布越宽，组成越复杂[23]。

图1 标样牛血清白蛋白的洗脱图Fig.1 Elution profiles of bovine aerum albumin

1.3.6 动态流变特性的检测 参考Don 等[19]的方法，采用流变仪检测GMP 凝胶的流变特性。在谷蛋白大聚体提取过程中，加入SDS 离心得到沉淀，沉淀表面的胶状物质为谷蛋白大聚体凝胶。用小勺子轻刮收集GMP 凝胶约1 g。将GMP 凝胶转移至流变仪平板中心，选择25 mm 直径的平行几何平板，平板间间隙为1 mm，加盖，静置5～10 min。采用应变扫描，温度20 ℃，固定频率1 Hz，应变扫描范围0.01%～100%。随着凝胶形变增加，应力基本不变的区域被称为线性黏弹区，其平台值分别代表样品的储能模量 （G′） 和损耗模量（G″），如图2所示。G′代表样品的固体或弹性特性，G″代表样品的液体或黏性特性。G″/G′定义为tanδ，当tanδ＞1 时，样品总体呈现液体或黏性体系；反之，当tanδ＜1 时，则呈现固体或弹性体系[24]。

图2 GMP 动态流变特性Fig.2 GMP dynamic rheology

1.4 数据分析

采用Excel 2010 整理数据，Origin 8.6 处理数据以及绘图。

2 结果与分析

2.1 灰分含量和亮度值（L*）

参试小麦的逐层碾磨粉、三皮三心粉路粉和六皮八心粉路粉的灰分含量和亮度值 （L*） 如图3a～3b 所示。越接近胚乳中心，灰分含量越低，L*值越高；越接近皮层，灰分含量越高，L*值越低。灰分含量在麦心粉中变化幅度较小，位置分辨率较低；L*值变化幅度较大，波动较大，故采用L*值和灰分含量的比值（简称L*/灰分）作为参试粉在籽粒中位置定量表征指标，即比值越小越靠近皮层，比值越大越靠近胚乳中心。

5 份逐层研磨粉、6 份三皮三心粉路粉和34份六皮八心粉路粉的位置编号与L*/灰分的关系如图3c 所示。45 份参试粉的位置编号与L*/灰分的线性回归系数R2（简称R2）为0.499（P＜0.01）；5份逐层研磨粉的位置编号与L*/灰分的R2为0.742（P＜0.05）；6 份三皮三心粉路粉和34 份六皮八心粉路粉的位置编号与L*/灰分的R2分别为0.894（P＜0.01）和0.530（P＜0.01）。

图3 小麦籽粒不同部位制粉的灰分（a）、亮度值L*（b）和L*/灰分（c）Fig.3 The ash content （a），lightness （b），L*/ ash （c） of flour from different fractions of wheat kernels

将碾米机逐层碾磨粉作为标准，位置编号3～7 的样品，分别对应小麦籽粒的亚糊粉层、胚乳外围、胚乳次外围、胚乳中心外围、胚乳中心。从图3c 可知，三皮三心粉路粉和六皮八心粉路粉所对应的小麦籽粒的不同部位，比如：三皮三心粉路粉中1M、2M 和3M，六皮八心粉路粉中1M1、1M2、1M3、2M1、2M2、3M1、4M1、5M1、1S 和DS 与 代 表胚乳中心的位置编号7 对应。如表2所示，对应位置编号6 和7 的三皮三心粉路粉的出粉率分别为50.1%和12.8%，对应位置编号5、6 和7 的六皮八心粉路粉的出粉率分别为5.5%，27.9%，40.4%。通过计算出粉率发现，三皮三心粉路粉样品的出粉率和逐层碾磨粉样品的出粉率类似。而六皮八心粉路粉的出粉率和逐层碾磨粉样品存在差别，胚乳中心的出粉率要低于前两种制备方式。

表2 不同制备方式的小麦籽粒不同部位制粉的出粉率Table 2 Extraction rate of flour from different fractions of different preparation methods

2.2 粗蛋白含量、干面筋和GMP 在总蛋白中占比

越接近胚乳中心，L*/灰分越大，粗蛋白的含量呈逐渐降低的趋势，如图4a 所示。45 份参试粉的L*/灰分与粗蛋白含量的R2为0.704（P＜0.01）；5 份逐层研磨粉的L*/灰分与粗蛋白含量的R2为0.844（P＜0.05）；6 份三皮三心粉路粉和34 份六皮八心粉路粉的L*/灰分与粗蛋白含量的R2分别为0.679（P＜0.05）和0.646（P＜0.01）。越靠近胚乳中心，45 份参试粉的干面筋、SDS 可溶蛋白和GMP含量均呈现出逐渐降低的趋势（数据未提供）。

如图4b 所示，L*/灰分越大，干面筋在总蛋白中占比呈逐渐增加的趋势，表明与粗蛋白含量的降低速率相比，干面筋含量的降低速率较小；45份参试粉的L*/灰分与干面筋在总蛋白中占比（简称干面筋占比）的R2为0.299（P＜0.01）；5 份逐层研磨粉的L*/灰分与干面筋占比的R2为0.985（P＜0.01）；6 份三皮三心粉路粉和34 份六皮八心粉路粉的L*/灰分与干面筋占比的R2分别为0.596（P＜0.05）和0.283（P＜0.01）。其中，六皮八心粉路粉中2T、D5、5BF、6M2、4M1 等5 份参试粉无法制得面筋，其干面筋占比按0 处理。如图4c 所示，L*/灰分越大，GMP 在总蛋白中占比基本不变，表明其降低速率与粗蛋白含量降低速率基本一致。

图4 小麦籽粒不同部位制粉的粗蛋白含量（a）、干面筋（b）和GMP（c）在总蛋白中的占比Fig.4 The content of crude protein （a） in flour，the content of dry gluten （b） and GMP （c） in total protein from different fractions of wheat kernels

2.3 面筋持水率和SDS 持溶剂力

小麦籽粒不同部位制粉的面筋持水率和SDS持溶剂力与L*/灰分的关系如图5所示。L*/灰分越大，面筋持水率呈现出逐渐增加的趋势；SDS 溶剂保持力呈现出逐渐降低的趋势。45 份参试粉的L*/灰分与面筋持水率、SDS 持溶剂力的R2分别为0.180（P＜0.01）和0.310（P＜0.01）；5 份逐层研磨粉的L*/灰分与面筋持水率、SDS 持溶剂力的R2分别为0.580 和0.497；6 份三皮三心粉路粉面筋持水率、SDS 持溶剂力的R2分别为0.692 （P＜0.05）和0.529（P＞0.05）；34 份六皮八心粉路粉与面筋持水率、SDS 持溶剂力的R2分别为0.213 （P＜0.01）和0.177（P＜0.05）。其中，六皮八心粉路粉中2T、D5、5BF、6M2、4M1 等5 份参试粉无法制得面筋，其面筋持水率按0 处理。

图5 小麦籽粒不同部位制粉的面筋持水率（a）和SDS 持溶剂力（b）Fig.5 Water holding capacity of gluten （a） and SDS holding capacity （b） of flour from different fractions of wheat kernels

2.4 SDS 可溶蛋白形貌

小麦籽粒不同部位制粉的SDS 可溶蛋白形貌特征如图6所示。越接近胚乳中心，L*/灰分越大，SDS 可溶蛋白重均摩尔质量和多分散指数呈现出波动后降低的趋势，z-均回转半径变化趋势不明显，密度总体呈逐渐降低的趋势。

图6 小麦籽粒不同部位制粉的SDS 可溶蛋白形貌Fig.6 Morphology of SDS soluble protein of flour from different fractions of wheat kernels

45 份参试粉的L*/灰分与密度的R2为0.096；5 份逐层研磨粉的L*/灰分与密度的R2为0.980（P＜0.01）；6 份三皮三心粉路粉与密度的R2为-0.203；34 份六皮八心粉路粉的L*/灰分与密度的R2为0.078。

2.5 小麦籽粒不同部位制粉的GMP 动态流变

小麦籽粒不同部位制粉的GMP 动态流变如图7所示。L*/灰分越大，GMP 凝胶的G' 和G'' 平台值均呈现逐渐增加的趋势；除个别样品存在波动，损耗因子整体上基本不变或呈现略有降低的趋势。

图7 小麦籽粒不同部位制粉的GMP 动态流变Fig.7 GMP dynamic rheology of flour from different fractions of wheat kernels

45 份参试粉的L*/灰分与G'、G'' 平台值的R2分别为0.511（P<0.01）和0.517（P<0.01）；5 份逐层研磨粉的L*/灰分与G'、G'' 平台值的R2分别为0.953（P<0.01）和0.931（P<0.01）；6 份三皮三心粉路粉的L*/灰分与G'、G'' 平台值的R2分别为0.268 和0.272；34 份六皮八心粉路粉的L*/灰分与G'、G'' 平台值的R2分别为和0.426（P<0.01）和0.429（P<0.01）。

3 讨论

越接近胚乳中心，灰分含量越低，L*值越高。使用L*/灰分比值表征籽粒部位，增加了表征指标的变化范围，提高了胚乳中心部位的分辨率，是定量表征参试粉在籽粒中位置的适宜指标。

研究发现，越靠近小麦籽粒胚乳中心，粗蛋白、干面筋、SDS 可溶蛋白和谷蛋白大聚体含量越低，这与前人发现小麦籽粒中蛋白质含量变化的结果一致[7，10，25-26]。从小麦籽粒的最外层到最内层，GMP 含量在总蛋白中的占比基本保持不变或略有下降。而干面筋的占比呈现出逐渐增加的趋势，这与He 等[5]的研究结果一致。越靠近胚乳中心，面筋持水率越高，面筋吸水能力越强，这与王义斌[27]研究发现胚乳中面筋蛋白分布由外向内的质量逐渐变好的观点一致。面粉SDS 持溶剂力逐渐降低与刘晓菲[28]研究小麦籽粒不同层次面粉SDS-沉降值变化趋势一致，却不同于Zhou 等[25]试验中SDS-沉降值变化趋势。

通过SEC-MALLS 研究了来自小麦籽粒不同部位SDS 可溶性蛋白的构象，其中Mw和Rgz可以指示聚合物的构象状态，这些变量之间的关系如式（5）所示。

常数α 推导溶液中聚合物的构象。从理论上讲，当α=0.33 时，聚合物构型为球形，而当0.4 <α<0.6 时，则存在无规卷曲，当α=1.0 时，构型为棒状[29]。此外，Mendichi 等[30]认为，当α＜0.33 时，聚合物的构象是致密的准球形。本试验中SDS 可溶性蛋白的α 值均低于0.33，所以其构型是准球形的，这与Zhao 等[31]结果相符。随着L*/灰分比值越大，离籽粒中心较近时，SDS 可溶蛋白的重均摩尔质量呈现出波动后降低的趋势，z-均回转半径变化趋势不明显，Mw/Rgz3值总体上呈现出逐渐降低的趋势，表明SDS 可溶蛋白聚集体形态变得松散，这个结果与Carceller 等[32]发现类似，随着蛋白质聚集体重均分子质量的增加，其致密性也增加。Stevenson 等[33]也验证了这一点，较低分子质量的蛋白质聚合物构象松散，而较高分子质量构象则更紧密。多分散指数总体上呈现出波动后降低的趋势，越靠近皮层，样品的成分越复杂。

GMP 如需检测形貌，需用超声将其分散在SDS 溶液中，已破坏其构象[34]，故采用动态流变学间接检测表征其形貌。GMP 粒子尺寸大小和浓度会影响GMP 凝胶的动态流变学性质[19]。GMP 在总蛋白中占比基本不变，而储能模量和损耗模量同时增加，说明GMP 凝胶结构存在差异[13]。可能是GMP 粒子构象疏松，增强了疏水氨基酸残基的暴露程度，加强了疏水相互作用，使得聚集体缠结概率增加。进一步增加了GMP 粒子尺寸，使储能模量和损耗模量呈现出增加的趋势[35]。

综上，小麦籽粒中心部位蛋白质的构象可能比其它部分松散，故当面筋蛋白含量基本相同时，籽粒中心部位样品会形成更大的面筋网络结构，包裹更多的蛋白质和水，引起干面筋占比增加，以及面筋持水率增加。此外，松散的蛋白质构象增加了蛋白质聚集体缠结的概率，引起储能模量和损耗模量平台值的增加。

4 结论

L*/灰分含量是定量表征小麦籽粒从外到内不同部位的有效指标。越接近小麦胚乳中心，粗蛋白含量越低，干面筋在总蛋白中占比越高，GMP 在总蛋白中占比变化趋势不明显；面筋持水率越高，SDS 溶剂保持力越低。SDS 可溶性蛋白的密度（Mw/Rgz3）总体上呈现出逐渐降低的趋势。GMP 凝胶的储能模量和损耗模量平台值呈现逐渐增加的趋势。基于这些结果推测，靠近胚乳中心蛋白质构象的结构松散，面筋网络能够包裹更多的蛋白质和水，松散的构象增加了聚集体缠结的概率，引起储能模量和损耗模量平台值的增加。