鸡蛋花茎皮总黄酮提取工艺优选*

张 斌，史士强，李宗莉，周长凯，李 静，韩志武，张 璐

（1.青岛大学附属医院药学部，山东 青岛 266000；2.南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515）

鸡蛋花茎皮为夹竹桃科鸡蛋花属鸡蛋花Plumeria rubraL.cv.Acutifolia 的干燥茎皮，资源丰富，药用价值较高，其有效成分包括生物碱、黄酮、皂苷等，黄酮有抗病毒、抑菌、消炎、保肝等作用，故鸡蛋花茎皮具有清热解毒、利胆退黄、消肿止痛等功效［1］。目前对鸡蛋花茎皮药用功效的研究多只限于民间使用和记载，导致其药用价值未能充分利用。本研究中采用正交试验联合星点设计-响应面法对鸡蛋花茎皮总黄酮的提取方法进行了研究［2-8］，测定其总黄酮的含量，从而确定最佳提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HH-S2 型数显恒温水浴锅、SHZ-D（3）型循环水式真空泵（上海申生科技有限公司）；XY-600B 型多功能粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KH-100DE 型数控超声波清洗器（东莞市科桥超声波设备有限公司）；YP1002 型及JA3003N 型电子天平（德国Sartorius 公司）；UV-2401PC 型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）。

1.2 试药

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号为100080-200707，含量＞98%）；无水乙醇、乙酸乙酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，水为蒸馏水。鸡蛋花茎皮药材，经南方医科大学中医药学院药用植物鉴定教研室陈兴兴副教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

2.1.1 溶液制备

称取芦丁对照品0.007 29 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加适量75%乙醇，超声（功率100 W，频率40 kHz，下同）使溶解，放冷至室温，加75%乙醇定容，摇匀，即得对照品溶液（0.145 8 mg/mL）。取药材粉末2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按各试验设计条件进行提取、滤过，合并提取液，并以75%乙醇定容至50 mL，即得供试品溶液。

2.1.2 检测波长选择

取2.1.1项下对照品溶液和供试品溶液各适量，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，最后加4.0 mL 1 moL/L氢氧化钠溶液，定容，摇匀，放置15 min，以“0”作为空白，进行全波长扫描。结果在507 nm 波长处溶液吸收较好，故以507 nm作为检测波长。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密吸取芦丁对照品0，1，2，3，4，5 mL 置不同10 mL 容量瓶中，在507 nm 波长处进样测定，以吸光度（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得芦丁回归方程Y=11.497X+0.001 6，r=1.000 0（n=5）。结果表明，芦丁质量浓度在0.014 58～0.072 90 mg/mL 范围内与吸光度线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液3.0 mL，在507 nm波长处进样测定，日内平行进样6次，计算日内精密度；连续测定6 d，计算日间精密度。结果日内精密度的RSD为0.19%（n=6），日间精密度的RSD为0.31%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取芦丁对照品溶液3.0 mL、供试品溶液0.5 mL，分别置10 mL 容量瓶中，在507 nm 波长处进样测定，室温下分别于0，10，20，30，40，50，60 min时进样，测定吸光度。结果的RSD为0.27%和0.68%（n=7），表明芦丁对照品溶液及供试品溶液在室温下放置60 min内稳定性较好。

重复性试验：精密吸取同一供试品溶液0.5 mL，共6 份，分别置10 mL 容量瓶中，在507 nm 波长处进样测定，记录吸光度。结果的RSD为0.38%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密吸取已知含量的供试品溶液6 份，加入一定质量浓度的芦丁对照品溶液。在507 nm波长处进样测定，记录吸光度并计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery tests（n=6）

2.2 单因素试验

提取溶剂选择：选择不同提取溶剂，每次用量18 mL，在50 ℃下超声60 min［9］，其他同2.1.1 项供试品溶液制备方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波长处进样测定，记录吸光度，并计算总黄酮含量。结果水、60%乙醇、乙酸乙酯、甲醇中黄酮含量分别为2.18%，2.75%，0.16%，1.89%。可见，相同条件下，乙醇提取的黄酮含量最高，其次为水。乙醇与水相互混合比例不同能使其极性发生变化，对于提取工艺的优化来说，具有可选择性，故选择乙醇作为提取溶剂。

提取方法选择：以乙醇为提取溶剂，每次用量18 mL，分别在50 ℃下超声、75 ℃下水浴加热、索氏回流提取1 次，其他同2.1.1项下供试品溶液制备方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波长处进样测定，记录吸光度，并计算总黄酮含量。结果分别为2.75%，1.84%，2.04%。可见，相同条件下，超声提取的鸡蛋花茎皮黄酮含量最高，故确定提取方法为超声提取法。

乙醇体积分数选择：以不同体积分数（40%，50%，60%，70%，80%，90%）的乙醇为提取溶剂，每次用量12 mL，在40 ℃下，超声提取2次，每次60 min，放冷至室温，称定质量，以相应乙醇补足减失的质量，其他同2.1.1项下供试品溶液制备方法，精密吸取各提取液0.5 mL，在507 nm 波长处进样测定，记录吸光度，并计算总黄酮含量。结果分别为2.27%，2.26%，2.32%，2.28%，2.36%，2.14%。可见，提取的总黄酮含量随乙醇体积分数的增大而增大，乙醇体积分数由40%变为50%时含量无明显变化，在60%～80%时含量较高，在80%时达最大值。故本研究中选用60%～80%乙醇作为提取溶剂。

2.3 正交试验

试验设计：在单因素试验基础上，以乙醇体积分数（因素A，%），提取时间（因素B，min），提取次数（因素C，次），提取温度（因素D，℃）为考察因素，以黄酮含量为评价指标，溶剂用量为每次12 mL，进行L9（34）正交试验，根据2.2 项下考察结果设计因素水平。详见表2。

表2 正交试验因素与水平Tab.2 Factors and levels of the orthogonal test

结果与分析：正交试验设计与结果见表3，可见，各因素对黄酮含量的影响极差大小为A ＞C ＞B ＞D，即对总黄酮含量影响最大因素是乙醇体积分数，其次为提取次数。方差分析结果见表4，可见，乙醇体积分数对总黄酮含量有显著影响。综合分析，故最佳提取工艺为A2B3C3D2，即70%乙醇提取3 次，每次90 min，提取温度为60 ℃。

表3 正交试验设计与结果Tab.3 Design and results of the orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Tab.4 Results of the ANOVA of the orthogonal test

验证试验：按选出的最优工艺条件重复试验3 次，结果总黄酮含量分别为2.39%，2.37%，2.52%（RSD=3.36%），3 次试验结果均能达到正交试验结果的较高值，说明最佳提取工艺条件稳定可靠。

2.4 星点设计-响应面法优化提取工艺

试验设计：结合单因素试验和正交试验结果，以乙醇体积分数、提取时间、提取温度为考察因素，溶剂用量为每次12 mL，提取3次。各因素的水平设计见表5、表6。

表5 星点试验因素与水平Tab.5 Factors and levels of the central composite design experiment

表6 星点试验设计与结果Tab.6 Design and results of the central composite design experiment

结果与分析：以总黄酮含量（Y，%）为因变量，试验结果用Design Expert 8.0.6.1 软件分析，进行多元二次回归拟合，得方程Y=7.7-0.16A-0.015B-0.012C+6.38 × 10-4AB+6.94 × 10-4AC-1.69 × 10-4BC+6.74×10-4A2-1.08×10-4B2-2.19×10-4C2。方差分析结果见表7。回归方程模型的P＜0.01，失拟性检验的P＜0.01，复合相关系数R2=0.848 9，表明该模型的拟合度良好，试验误差较小，可用于该模型预测试验结果。模型系数显著性结果表明，该模型的一次项A（P＜0.05）和B（P＜0.01），以及二次项AB（P＜0.05）对黄酮含量影响显著（P＜0.05），表明乙醇体积分数和提取时间对总黄酮的含量影响显著。综上所述，各因素对黄酮含量的影响显著性由大到小依次为提取时间、乙醇体积分数、提取温度。

表7 星点试验方差分析与结果Tab.7 Results of the ANOVA of the central composite design experiment

响应面分析：响应面优化法在试验条件的优化过程中，可依次对单个试验因素进行分析，也可连续对各个试验因素进行分析［10-11］。用Design Expert 8.0.6.1软件绘制不同影响因素对响应值的三维曲线图，详见图2。根据模型方程和响应曲面图确定鸡蛋花茎皮总黄酮的最佳提取工艺为75.77%乙醇提取3 次，每次77.32 min，提取温度为63.90 ℃。

验证试验：根据预测的鸡蛋花茎皮总黄酮的最佳提取工艺条件，进行3次验证试验，比较预测值与真实值的差异。其中，总黄酮的预测值为1.89%，真实值分别为1.89%，1.88%，1.88%，平均1.88%（RSD=1.21%），预测值与真实值的偏差约为0.01%。说明建立的模型预测性较好，可用于鸡蛋花茎皮总黄酮的提取工艺优化。

3 讨论

超声提取是利用超声波具有的机械、空化和热效应，通过增大介质分子的运动速度、穿透力以提取生物的有效成分［12］。而水浴加热提取和索氏回流提取是利用热效应来加快介质分子的运动以提取生物的有效成分。因此，本研究中选择的超声提取更加充分和全面，这也为中药提取方法的研究提供了依据。

考察提取溶剂、乙醇体积分数在单因素试验中，选取了60%～80%乙醇为提取溶剂［13］。黄酮成分的存在形式包括苷和苷元，苷元极性小，而苷极性较大，前者难溶于水，但易溶于乙醇等有机溶剂，后者易溶于水、乙醇、甲醇等极性较强的溶剂。因此，乙醇对黄酮的溶解性较大，其与水的不同浓度梯度也为黄酮的提取提供了更多选择，且以水与乙醇为溶剂提取时操作简单，成本较低。

本研究中2 种试验方法所优化的最佳工艺结果相近，星点设计的试验次数比正交试验多，但优化工艺更准确直观，且因素水平范围设计更加合理、准确。响应值多在最佳工艺条件附近变化灵敏，试验条件的微小变化都会产生较大变化，而试验条件远离优化区域，其变化趋势逐渐减小，线性越好，故所选星点设计适用于非线性模型拟合，而本研究中也通过模型拟合进行了二次项拟合，该模型也具有显著性。

本研究中由于试验期间方案设计不合理，重复某一环节多次，以致原药材不足，星点设计-响应面法试验中所用药材为第2次采割，但由于鸡蛋花茎皮为不同季节（2015年7 月、2016年3 月）采割，黄酮含量差异较大［14-15］，可能是黄酮成分受温度影响较大，部分已转化为异构体或其他成分，但并不影响本研究中鸡蛋花茎皮黄酮提取工艺的优化。