Box-Behnken 响应面法优选生化汤智能提取工艺*

马 赟，李存玉

（1.江苏省泰州市第四人民医院，江苏 泰州 225300；2.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023）

中药处方由执业中医师通过对患者机体的状况辨证开具，在调剂过程中患者根据个人需求，可委托医院药房代煎，或按医嘱自行煎煮。但患者常质疑2 种煎煮方法下的成品是否存在成分差异。由于缺乏传统煎煮与医院智能提取效率的对比研究，且针对该方面的研究处于探索阶段，尚不能从根本上解决患者的疑问［1-3］。中药处方的药效物质基础是质量评价的关键指标，目前多通过指标性成分、固形物等参数进行综合评价［4-5］。本研究中基于医院临床调剂中的常用处方，结合中药组成特点，选择生化汤（组方：当归24 g，川芎9 g，桃仁6 g，姜炭和炙甘草各2 g）为研究对象［6］，通过陶罐直火煎煮（传统方法）、智能煎药机提取，以阿魏酸、藁本内酯、固形物为直观指标，且为了保证传统煎煮与智能煎煮制备生化汤中物质基础的一致性，以生化汤中藁本内酯和阿魏酸含量比值（P1），阿魏酸、藁本内酯总含量与生化汤煎液中固形物比值（P2）为间接指标，优选智能煎药机煎煮参数，为临床常用中药处方的调剂、煎煮提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

JY-C2 型全自动煎药包装一体机（济南玖延机械有限公司）；Agilent 1100 型高效液相色谱仪，包括VWD型检测器（美国Agilent 公司）；AEL-40SM 型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；HH-S1 型数显恒温水浴锅（郑州豫华仪器制造有限公司）；SK1200H 型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；101-A3型干燥箱（无锡琼瑞特科技有限公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为0773-9910，含量≥98.0%）；藁本内酯（南京金益柏生物技术有限公司，批号为JBZ-0405，含量≥98.0%）；甲醇、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，水为超纯水。当归、川芎、桃仁、姜炭、炙甘草饮片均来源于医院药剂科中药房，经药剂科石梅副主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 阿魏酸及藁本内酯含量测定

2.1.1 色谱条件［7］

色谱柱：Agela Vensuil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～10 min时10%A →28%A，10～17 min 时28%A →65%A，17～25 min 时65%A，25～30 min 时65%A →100%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.1.2 溶液制备

混合对照品溶液：分别称取阿魏酸3.60 mg、藁本内酯5.32 mg，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加乙醇超声（功率250 W，频率40 kHz）处理20 min，用乙醇定容，即得阿魏酸和藁本内酯质量浓度分别为360 μg/mL 和532 μg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液1：按生化汤处方工艺称取处方饮片，按传统煎煮方法加入自来水500 mL浸过药面，武火煮沸后转文火煎煮10 min，滤过；加入自来水400 mL，采用相同方法煮沸10 min，滤过；合并2次滤液，即得。

供试品溶液2：按生化汤处方工艺称取10倍处方量饮片，设定一体机提取参数操作，即得。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取2.1.2项下混合对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mL，置10 mL 容量瓶中，用乙醇定容，得系列混合对照品溶液。精密量取10 μL，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（Y）、待测成分质量浓度为横坐标（X）进行线性回归。得回归方程阿魏酸为Y1=492.5X1+428.3（R12=0.998 2，n=5），藁本内酯为Y2=729.9X2-430.7（R22=0.999 6，n=5）。结果表明，阿魏酸和藁本内酯质量浓度分别在3.60～72.00 μg/ mL 和5.32～106.40 μg/ mL 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限考察：精密量取2.1.2项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，并按2.1.1 项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）10∶1 和3∶1 时的质量浓度分别记作定量限和检测限。结果阿魏酸和藁本内酯的定量限分别为0.36，2.66 μg/ mL，检测限分别为0.12，0.89 μg/mL。

精密度试验：取2.1.2 项下供试品溶液1 适量，按2.1.1项下色谱条件，同1 d 内连续进样测定6 次，记录峰面积，计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度。结果阿魏酸和藁本内酯的日内精密度分别为0.83%和1.15%（n=6），日间精密度分别为2.69%和4.74%（n=6），表明方法日内、日间精密度良好。

稳定性试验：取2.1.2 项下供试品溶液2 适量，分别于室温下放置0，1，2，6，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果阿魏酸、藁本内酯峰面积的RSD分别为0.95%和1.31%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：按生化汤处方工艺称取饮片适量，各6 份，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液1，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果阿魏酸、藁本内酯峰面积的RSD分别为1.26%和1.75%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：按生化汤处方工艺称取饮片适量，各6 份，加入一定量混合对照品溶液，按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果阿魏酸和藁本内酯的平均加样回收率分别为98.56%和101.32%，RSD分别为1.56%和2.04%（n=6）。

2.2 固形物含量测定

精密量取供试品50 mL，置烘干至恒重的100 mL蒸发皿中，水浴100 ℃蒸干，放至103 ℃烘箱内烘2 h，取出，置干燥器30 min，冷却，称定质量；再放至103 ℃电热烘箱内烘1 h，取出，置干燥器30 min，重复操作至恒重，根据公式1［G=（m-m0）/ 50］计算固形物质量浓度。式中，G为固形物的质量浓度（g/ mL），m为固形物和蒸发皿的质量（g），m0为蒸发皿的质量（g）。

2.3 间接指标

P1和P2。计算方法见公式2（P1=m1/m2）和公式3［P2=（m1+m2）/GV］。式中，m1为生化汤中阿魏酸含量（mg），m2为生化汤中藁本内酯含量（mg），G为固形物的质量浓度（g/mL），V为生化汤药液体积（mL）。

2.4 响应面试验

以提取时间、加水量、提取次数3 个因素为变量，以-1，0，1 代表变量水平（见表2），进行Box-Behnken三因素三水平试验［8-10］，以阿魏酸、藁本内酯、固形物含量为指标，优选智能煎药机提取工艺。方案及结果见表1及表2。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and levels

表2 响应面试验设计及结果Tab.2 Design and results of the response surface test

2.5 回归方程拟合与显著性分析

阿魏酸：根据Design-Expert 8.06软件中Box-Behnken中心组合设计功能，对表3 中阿魏酸含量（Y阿）结果进行多元回归拟合，得到阿魏酸含量与考察因素变量之间的回归方程，Y阿=120.10+38.54A+8.08B+45.01C+5.40AB+17.37AC+6.95BC-27.49A2-13.11B2-19.99C2。由表3可见，该回归方程模型显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.129 7 ＞0.05），说明该模型用于预测、优选阿魏酸提取参数成立。考察因素中对阿魏酸含量影响强度的排序为C ＞A ＞B，其中所考察因素间均存在显著交互作用（P＜0.05）。

藁本内酯：藁本内酯含量（Y藁）与考察因素变量间的回归方程，Y藁=170.50+127.28A+9.06B+107.09C+11.20AB+100.15AC+5.47BC+2.79A2-17.59B2-36.04C2。由见表3可见，回归方程模型显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.091 6 ＞0.05），说明该模型用于预测、优选藁本内酯提取参数成立。考察因素中对藁本内酯含量影响强度的排序为A ＞C ＞B，其中所考察因素间均存在显著交互作用（P＜0.05）。

固形物：固形物含量（Y固）与考察因素变量间的回归方程：Y固=118.40+47.24A+13.54B+42.90C+9.05AB+21.63AC+2.83BC-19.70A2。由表3可见，固形物回归方程模型显著（P ＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.5 374 ＞0.05），说明该模型用于预测、优选生化汤中固形物提取参数成立。考察因素中对固形物含量影响强度的排序为A ＞C ＞B，其中所考察因素间AB 和AC均存在显著交互作用（P ＜0.05）。

表3 响应面二次回归模型的方差分析Tab.3 ANOVA of quadratic regression model of response surface

P1：根据因素与响应值之间的方差分析结果，调整P1与考察因素变量之间的回归方程为P1=1.39 +0.80A-0.044B+0.53C+0.48AC+0.15A2-0.37C2。回归方程模型显著（P=0.000 4），相关系数R2=0.961 1，调整相关系数R2=0.911 0，可用于根据P1设定值优选因素水平。

P2：P2与考察因素变量之间的回归方程为P2=2.47+0.61A-0.22B+0.62C-0.10AB+0.39AC-0.46C2。回归方程模型显著（P ＜0.000 1），相关系数R2=0.939 2，调整相关系数R2=0.902 7，可用于根据P2设定值优选相应因素水平。

2.6 响应面分析

阿魏酸：三因素间均存在交互作用，其中提取时间和提取次数交互作用强于其他二者，随着提取时间或提取次数的增加，阿魏酸在生化汤中的含量均呈增加进而趋于稳定的状态。提取次数与加水量的交互作用体现出，在提取次数相对固定时，6～12 倍加水量范围内生化汤中阿魏酸含量相对稳定，说明6倍加水量即可满足阿魏酸的提取。结果见图1。

藁本内酯：其中提取次数与提取时间交作用显著，在提取次数为1 次时，随着提取时间由5 min 增至20 min，生化汤中藁本内酯含量并未出现明显增加，说明在单次提取时，时间低于20 min，藁本内酯提取效果低下。当提取次数增加至3次时，随着提取时间的延长，生化汤中藁本内酯含量增加明显，在提取3次、每次20 min时，藁本内酯含量最高，说明在所考察因素水平范围内，藁本内酯提取尚不完全［11-12］。而提取次数与加水量之间交互作用不显著，呈现出在固定提取时间、提取次数时，增加加水量对生化汤中藁本内酯含量影响并不明显。结果见图2。

固形物：其中提取次数与提取时间交作用显著，但在固定加水量参数时，提取次数为1 次时，随着提取时间由5 min 增加至20 min，固形物并未明显增加。同时，固定提取时间在5 min 时，提取次数由1 次增加至3 次，生化汤煎煮液中固形物也未明显增加，说明生化汤组方（当归、川芎、桃仁、姜炭、炙甘草）固形物溶出是逐渐积累的过程。结果见图3。

2.7 验证试验

优选出的最佳提取工艺为提取19.20 min，加6 倍量水，提取2次。按处方工艺取中药饮片适量，采取全自动煎药包装一体机煎煮。得生化汤中阿魏酸、藁本内酯、固形物平均含量（见表4）。计算得P1为2.29，P2为3.34，均与传统制备方法下的各指标性成分比例理论值（2.32，3.38）相近，表明模拟煎药机提取效果的模型可行，可用于生化汤的智能煎煮。

表4 验证试验结果Tab.4 Results of the verification test

3 讨论

2018年，国家中医药管理局《古代经典名方目录（第一批）》规定了经典名方中药复方制剂及其物质基准研究要求，强调复方制剂与物质基准的一致性。生化汤为妇科常用方剂，临床使用量大，通过以传统煎煮方法为基准，优选智能化煎药机提取参数，在实现煎煮药液中指标性成分一致性的同时，也保障了临床疗效［13-14］。

响应面分析法可通过较少的试验设计，完成多因素、多水平考察，较正交设计法和均匀设计法更全面，可用于预测试验范围内任何试验点的理论值，在实际应用时设计的因素水平范围要包括最优条件［15-19］。

中药处方的传统煎煮向自动化提取的过渡，目前多用单因素考察寻找适宜的提取参数，响应面法可真正筛选出最优参数，提高参数筛选效率。本研究中优选出的最佳提取工艺为提取19.20 min，加6 倍量水，提取2 次，实际提取效果为阿魏酸含量110.30 mg，藁本内酯含量252.73 mg，固形物含量108.45 g，与预测值相近。

采用全自动煎药包装一体机制备生化汤时，采取处方量放大10倍，相较于煎药壶中指标性成分含量，自动煎药机的提取效率约为传统煎煮方式的1.3倍。因处方量增加带来的药液体积增加，从提取开始至溶液沸腾的时间也相对延长，处方饮片的温浸时间延长，从而引起指标性成分含量增加［20］。临床调剂使用时，可按一定比例稀释，或降低药液分装体积，以保证服用量与煎药机提取药液的一致性。