LR12 肽通过调控TLR-4/ NF-κB 信号通路对坏死性小肠结肠炎新生小鼠肠道损伤的影响

占彩霞 廖镇宇 黄瑞文 刘银芝 杨 慧

湖南省儿童医院新生儿科，湖南长沙 410007

坏死性小肠结肠炎（necrotic enterocolitis，NEC）是以肠道炎症为特点的消化系统疾病，常发生于早产儿，由于复杂的发病因素，临床上缺乏有效治疗手段，死亡率约为30%[1]。NEC 病情进展较快，目前尚未完全阐明其发病机制，但认为肠黏膜屏障结构和功能的改变及肠道炎性损伤是其发病基础[2]。髓细胞触发受体1（triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1）是一种炎症激发受体，能通过激活TLR-4/NF-κB 信号通路放大炎症级联反应，其在脓毒症、结肠炎等炎症疾病中发挥重要作用[3-5]。作为一种TREM1特异性抑制肽，LR12 肽能够捕获TREM1 配体，阻断TREM1 介导的炎症反应，具有显著的抗炎作用[6]，目前已被美国食品药品监督管理局批准为治疗脓毒性休克的药物。但目前还未知晓LR12 肽对NEC 是否有治疗效果，为此，本研究通过构建幼鼠NEC 模型，并进行LR12 肽干预，探讨LR12 肽对NEC 的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠18 只（雌性6 只，雄性12 只），8 周龄，体重16～23 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2019-031，动物合格证号：No.1103241911007575。实验遵循国家实验动物伦理规范。

1.2 主要试剂

LR12 肽（LQEEDTGEYGCV）及其无效肽LR12 scramble（YQMGELCAGEED）由北京赛百盛基因技术有限公司合成并提供；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，货号：SMB00704）、异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITCDextran，货号：46944）购自美国Sigma-Aldrich 公司；鼠白细胞介素（interleukin，IL）-1β（货号：CSB-E08054m）、IL-6（货号：CSB-E04639m）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，货号：CSB-E04741m）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自武汉华美生物有限公司；TREM1（11791-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；TLR-4（货号：14358S）、MyD88（货号：4283S）、NF-κB p65（货号：6956S）、IκBα（货号：4814S）、GAPDH（货号：51332S）抗体购自美国CST 公司；ECL 显影试剂盒购自美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 分组、造模及给药 将雌鼠和雄鼠按照1∶2 合笼受孕，孕鼠共计产仔60 只。采用随机数字表法将幼鼠分为四组（n=15）：对照组、模型组、LR12-scr 组（作为阴性对照）和LR12 组。将2 日龄幼鼠置于保育箱，喂养方式采用人工喂养，代乳品及喂养剂量参考文献[7]配制。对照组不做任何操作，其余三组采用缺氧冷刺激+LPS 干预法[8]构建NEC 模型：将幼鼠放入90%氮气中缺氧90 s，然后置于4℃冰箱进行冷刺激10 min，再腹腔注射7 mg/kg LPS，连续操作3 d。造模结束后，若幼鼠NEC 临床症状评分≥8 分视为模型成功[9]。模型成功且无死亡。LR12-scr 组腹腔注射5 mg/kg LR12 scramble，LR12 组腹腔注射等剂量LR12 肽，对照组和模型组给予等量溶剂，1 次/d，连续3 d。

1.3.2 幼鼠临床症状评分 记录所有幼鼠实验前后的体重，并于实验结束时参考文献[10]进行临床症状评分。见表1。

表1 NEC 临床症状评分标准

1.3.3 检测肠黏膜通透性 所有幼鼠灌胃40 mg/g 的FTTC-Dextran 溶液，4 h 后眼眶取血，3500 r/min 离心10 min，离心半径为15 cm。采用酶标仪测定血浆荧光强度，制作标准曲线并计算其浓度。

1.3.4 苏木精-伊红（hematoxylineosin,HE）染色所有幼鼠取回盲部肠组织固定24 h 后取出，石蜡包埋后切片5 μm，行HE 染色。参考Nadler 标准[9]进行双盲评分，评分≥3 分者视为NEC 样肠损伤。见表2。

表2 Nadler 评分标准

1.3.5 检测肠组织中炎症因子水平 取所有幼鼠肠组织制备组织匀浆，在4℃，3000 r/min 离心15 min，离心半径为15 cm，取上清，按照试剂盒说明书的步骤检测TNF-α、IL-1β 和IL-6 的表达水平。

1.3.6 检测相关蛋白表达 取所有幼鼠肠组织裂解成组织匀浆，12 000 r/min 离心20 min，离心半径为15 cm，取上清，按照BCA 法进行蛋白定量。取25 μg 蛋白，经SDS 凝胶电泳，转膜，加入TREM（1∶1000）、TLR-4（1∶1000）、MyD88（1∶1000）、NF-κB p65（1∶500）、IκBα（1∶500）和GAPDH（1∶1000）孵育，TBST 清洗，加入相应属性二抗（1∶10 000），膜滴加ECL 试剂后，采用全自动化学发光分析仪进行显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组幼鼠实验前后体重变化、临床症状积分比较

各组实验前体重比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），实验后模型组体重低于对照组，而LR12 组体重高于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；模型组临床症状积分高于对照组，LR12 组积分低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05），而LR12-scr 组积分与模型组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表3。

表3 各组幼鼠实验前后体重变化、临床症状积分比较（）

表3 各组幼鼠实验前后体重变化、临床症状积分比较（）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

2.2 各组幼鼠肠组织病理学及肠黏膜通透性比较

对照组肠组织病理结构正常。模型组和LR12-scr 组肠组织绒毛杂乱，部分绒毛脱落甚至缺失，肌层变薄。LR12 组肠组织结构较清晰，绒毛坏死或脱落现象减少。见图1。模型组肠组织病理学评分和血清FITC-Dextran 含量高于对照组，LR12 组病理评分和血清FITC-Dextran 含量低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05），而LR12-scr 组以上数据与模型组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表4。

表4 各组幼鼠肠组织病理学评分及血清FITC-Dextran 含量比较（）

表4 各组幼鼠肠组织病理学评分及血清FITC-Dextran 含量比较（）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05

图1 HE 染色观察肠组织病理学变化

2.3 各组幼鼠肠组织炎症因子水平比较

模型组TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平高于对照组，LR12 组TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平低于模型组，差异均有统计学意义（P ＜0.05），而LR12-scr 组以上指标与模型组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表5。

表5 各组幼鼠肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比较（ng/L，）

表5 各组幼鼠肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平比较（ng/L，）

注 与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-6：白细胞介素-6

2.4 各组幼鼠肠组织中TREM1 蛋白及TLR-4/NF-κB信号通路相关蛋白表达变化

与对照组比较，模型组肠组织中TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平升高，IκBα 蛋白水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与模型组比较，LR12 组TREM1、TLR-4、MyD88 和NF-κB p65 蛋白水平降低，IκBα 蛋白水平增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而LR12-scr 组以上指标与模型组比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图2。

图2 各组幼鼠肠组织中相关蛋白表达水平（n=15）

3 讨论

LPS+低氧刺激是反应人类NEC 最成功的建模方法[11]。本研究结果显示，模型组幼鼠表现出明显的NEC症状，并出现严重的肠损伤、肠黏膜屏障受损，炎症加重等变化，说明NEC 模型成功。然而，本研究采用LR12 肽干预后，幼鼠NEC 症状有所缓解，肠道损伤减轻，肠黏膜通透性改善，炎症水平降低，并且显著抑制TREM1 表达和TLR-4/NF-κB 信号通路的活化。提示，LR12 肽对NEC 具有改善作用。

TREM1 是一种新型炎症激发受体，其可激活并放大TLR-4/NF-κB 信号通路，促进促炎因子的释放[12-14]。Shen 等[15]研究显示，溃疡性结肠炎疾病的严重程度和活动度与TREM1 显著相关。相关研究[16-17]报道，下调TREM1 表达可抑制小鼠结肠炎炎症反应及相关肿瘤的发生。作为TREM1 特异性抑制肽，LR12 肽常应用于TREM1 介导的炎症反应的相关研究中，并已成为一种治疗脓毒症休克的临床用药[18]。然而，LR12 肽对NEC 的影响尚不清楚。本研究结果显示，采用LR12肽干预后，NEC 幼鼠临床症状有所改善，并且肠组织损伤减轻，肠黏膜通透性及肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平均降低，提示LR12 肽对NEC 具有一定的改善作用。本研究进一步显示，NEC 幼鼠肠组织中TREM1蛋白表达水平显著增加，而LR12 肽干预可抑制NEC幼鼠肠组织中TREM1 蛋白表达，提示LR12 肽对NEC的改善作用可能与抑制TREM1 表达有关。

TLR-4/NF-κB 信号通路是调控炎症反应的主要通路之一，且TREM1 介导的炎症反应均由该信号通路发挥作用。TLR-4 激活后会通过MyD88 触发信号，降解IκBα 和释放NF-κB p65，从而激活NF-κB[19-20]。而NF-κB 作为核转录因子，可诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达[21]。肠道免疫系统异常激活导致的炎症“瀑布”效应是NEC 发病的关键因素[22-23]。众多研究[24-25]显示，抑制TLR-4/NF-κB 信号通路活化可改善NEC 肠损伤，降低炎症反应。Shi 等[26]研究显示，LR12肽通过降低TREM 1 的表达，抑制NF-κB 信号通路的激活来缓解LPS 诱导的急性肺损伤。本研究结果显示，NEC 幼鼠肠组织中TLR-4/NF-κB 炎症信号通路异常活化。采用LR12 肽干预后，NEC 幼鼠肠组织中TLR-4/NF-κB 炎症信号通路受到抑制。因此，LR12肽可能通过下调TREM1，进而抑制TLR-4/NF-κB 炎症信号通路活化，最终降低炎症反应及肠黏膜通透性，改善NEC 肠道损伤。

综上所述，LR12 肽能够改善肠黏膜通透性，抑制肠组织炎症反应，从而减轻肠组织损伤，其机制可能与抑制TLR-4/NF-κB 信号通路活化有关，本研究可为NEC 疾病的预治疗提供了新的方向。