正交试验法优选复方益肾利石颗粒的提取工艺

覃新华 陈 娟 李 岩 游 攀 胡传义

1.宁夏医科大学研究生培养基地 上海市浦东新区公利医院，上海 200135；2.上海市浦东新区公利医院泌尿外科，上海 200135

复方益肾利石汤是上海市浦东新区公利医院的临床经验方，主要用于泌尿系结石的辅助治疗，经长期用药观察，复方益肾利石汤可显著降低术后肾损伤、结石残留率和并发症发生率[1-3]。全方由金钱代化草、海金沙、生鸡金等药材组成。本实验按照现代中药药物制剂的需求优化提取工艺，使其适合现代生产[4]。采用单因素考察和正交设计[5]，以方中有效成分的综合评分为评价指标，对溶剂倍数、提取时间及提取次数进行考察，确定最佳提取工艺，为颗粒提取工艺提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

XS105 十万分之一电子天平[（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）]；DK-S26 六孔水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；UV-2102PCS 紫外-可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；Agilent1200 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；MWD 检测器（美国安捷伦科技公司）。

1.2 试药

海金沙、金钱草、生鸡金、石苇、车前子、川断、杜仲、枳壳、炒蒲黄药材均购于上海万仕诚药业有限公司（批号分别为：200111-1、200103-1、200227-1、200217-1、200211-1、200226-1、200213-1、191218-1、191218-1）；川续断皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷对照品、芦丁均来源于中国食品药品检定研究院（批号分别为：39524-08-8、110722-201815、111857-201804、100080）；超纯水（广州屈臣氏饮料食品有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（上海默克化工技术有限公司，批号分别为：166579、2019706）。

2 方法与结果

2.1 评价指标

按照《中华人民共和国药典》2020 年版[6]和相关文献资料[7-8]，分别制备9 味药的提取样品，经检测，选取总黄酮、川续断皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷含量及其转移率作为提取工艺的考察指标。

复方益肾利石颗粒样品的制备：海金沙30 g、金钱草30 g、生鸡金30 g、石苇15 g、车前子20 g、川断12 g、杜仲12 g、枳壳15 g、炒蒲黄15 g，加8 倍量水，提取3 次，每次1 h，得提取物，真空干燥、粉粹得浸膏粉。

2.1.1 总黄酮含量测定 ①溶液的制备，取芦丁对照品25 mg 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇适量，超声溶解，放冷，加30%乙醇至刻度，取上述溶液10 ml 置50 ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得对照品溶液。取本品1 g（批号：2020072901）置具塞锥形瓶中，加30%乙醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，滤过。取续滤液5 ml 置50 ml 量瓶中，加30%乙醇至刻度，即得供试品溶液。②线性关系考察[9]，吸取芦丁对照品储备液制备成系列标准曲线溶液，浓度分别为：0.099、0.198、0.297、0.396、0.495 mg/ml，于510 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标（Y），以浓度为横坐标（X），绘制回归曲线。结果总黄酮的回归方程为Y=1.3212X-0.0022（r2=0.9999），表明总黄酮在0.099～0.495 mg/ml 范围内线性关系良好。③精密度试验，取供试品溶液3 ml，于510 nm 波长处连续测定6 次。结果吸光度的相对标准偏差（RSD）=0.16%（n=6），提示仪器的精密度良好。④稳定性试验，取供试品溶液1 ml 置10 ml 量瓶中，依次在510 nm 波长下，分别测定0、0.5、1、1.5、2、3 h 时间点溶液的吸光度。结果，总黄酮含量的RSD=0.43%（n=6），提示供试品溶液在3 h 内稳定性良好。⑤重复性试验，取同一批号的样品6 份（批号：2020092301），参照①项方式制备供试品溶液。依次在510 nm 波长处进行测定，结果吸光度的RSD=1.49%（n=6），提示本方法重复性良好。⑥加样回收率试验，称定已知总黄酮含量的同一批号的供试品溶液6 份（批号：2020092301），加芦丁对照品，参照①项下方式制备供试品溶液。于510 nm 波长处进行测定并计算加样回收率。结果显示，总黄酮平均回收率为98.08%（RSD=0.01%，n=6），显示该方法具有良好的加样回收率。见表1。

表1 总黄酮含量测定回收率试验结果

2.1.2 柚皮苷、新橙皮苷含量测定 色谱条件[10-11]：高效液相仪，Agilent 1200、MWD 检 测器、Agilent 1200 工作站；色谱柱，Symmetry C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相，乙腈-水（20∶80）（用磷酸调节pH 值至3）；检测波长283 nm。对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品、新橙皮苷对照品适量，加甲醇分别制成每1 ml 含柚皮苷1.0 mg、新橙皮苷0.5 mg 的标准溶液。供试品溶液的制备：取浸膏粉0.2 g 置具塞锥形瓶中，加甲醇50 ml，加热回流提取1.5 h，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量。取续滤液10 ml 置25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.1.3 线性关系考察 取柚皮苷、新橙皮苷对照品溶液，按上述色谱条件进行测定，分别以对照品进样浓度的对数值（X）为横坐标，峰面积的对数值（Y）为纵坐标，绘制回归曲线。见表2。可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.1.4 精密度试验 取同一供试品溶液10 μl，注入液相色谱仪，连续进样6 次，记录峰面积。测定柚皮苷、新橙皮苷峰面积峰RSD 均<3%，显示仪器的精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取供试品溶液1 份，分别于0、2、4、6、8、10、12 h 进样，得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD分别为0.16%和0.19%，显示供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取供试品溶液6 份，精密吸取注入液相色谱仪测定，得柚皮苷、新橙皮苷峰面积RSD 均<2%，显示该方法重复性良好。

2.1.7 加样回收率试验 称取已知柚皮苷、新橙皮苷含量的供试品6 份（批号：2020092303），分别加入适量对照品溶液。分别吸取供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，计算平均加样回收率和RSD。结果测得柚皮苷的平均加样回收率为98.33%，RSD 为0.35%，新橙皮苷的平均加样回收率为99.31%，RSD 为0.17%。见表3～4。

表3 柚皮苷加样回收率

表4 新橙皮苷加样回收率

2.2 提取工艺条件的研究

2.2.1 浸泡时间及药材吸水率考察 称取半分处方药材（共89.5 g），加10 倍量水，浸泡0.5、1、2、3、4、5、6、24 h 后过滤，称药渣重量，测吸水率[12]。从图1 可知，药材浸泡30 min 时吸水量为1.3 倍，在2 h 后的吸水量趋向于平缓。故从生产的实际出发，提取浸泡时间定为0.5 h。

图1 吸水率试验

2.2.2 提取次数 取4 份全处方量药材，分别加8 倍量水，提取时间1 h，提取1、2、3、4 次各指标有效成分。从图2 可知，随提取次数增加，各指标有效成分溶出不断增加，但提取次数增加至第4 次，含量增长速率变缓。参照实验室和工业化生产的实际情况，选择提取1、2、3 次进行正交试验。

图2 提取次数试验

2.2.3 提取时间 取5 份全处方量药材，加8 倍量水，分别提取0.5、1、1.5、2、3 h 各指标有效成分，提取2 次[13-14]。从图3 可知，在提取0.5～1 h，三种成分不断增加，超过1.5 h 后，含量均呈下降平稳趋势，故选择0.5、1.0、1.5 h进行正交试验。

图3 提取时间试验

2.2.4 溶剂倍数 取4 份全处方量药材，分别加6、8、10、12 倍量水，提取1 h，提取2 次[15-16]。从图4 可知，有效成分溶出在4～8 倍加水量，随水量的增加不断增加，超过10 倍水量后，各含量均呈下降趋势，故选择加6、8、10 倍水进行正交试验。

图4 溶剂倍数试验

2.2.5 正交试验 在上述实验的基础上，进一步优化复方益肾利石颗粒的提取工艺，采用三因素三水平设计[17-19]，考察空白（A）、提取次数（B）、提取时间（C）和溶剂倍数（D）因素对各指标及得膏率的影响。按照L9（34）正交表进行正交试验。正交设计因素水平见表5～6。本研究应用多指标综合评分法优化颗粒的提取工艺[20]，利用层次分析法[21]得各指标权重系数，见表7。综合评分=总黄酮总含量得分×0.4452+川续断皂苷Ⅵ转移率得分×0.3086+柚皮苷转移率得分×0.1118+新橙皮苷转移率得分×0.1118+干膏得率得分×0.0226。正交设计及综合评分结果见表8～9，通过综合评分的方差分析可知提取次数＞提取时间＞溶剂倍数＞空白，即B＞C＞D＞A，差异有统计学意义（P ＜0.05）；通过综合评分的直观分析可知因素B 中K3＞K2＞K1，提示提取次数的增加，综合评分越高；因素C中K2＞K3＞K1，选择提取时间为1 h；因素D 中K3＞K2＞K1，K3 和K2 相差极小，选择溶剂倍量为8 倍。综合评分的最佳组合为B3C2D1，即最佳提取工艺为：8 倍量水，提取3 次，每次1 h。

表5 因素水平设计方案

表6 正交试验安排

表7 各成分权重系数

表8 正交试验结果

2.3 验证实验结果

称取处方中9 味药材，共3 份，按优选工艺进行提取。结果浸膏得率均值为22.54%，总黄酮总含量均值为1762.09 mg，川续断皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷转移率均值分别为36.92%、97.71%、78.25%，三批验证样品的转移率RSD 均＜7.0%，出膏率RSD ＜3.0%，结果显示提取工艺稳定，可重复，适用于大生产。

3 讨论

本研究充分考虑复方益肾利石颗粒的安全性、有效性，建立多个指标的综合评分法考察提取工艺[22-24]。综合评分法是中药提取工艺多个指标评价的常用方法，能更好反映复方中药的安全性、有效性、整体性及复杂性[25]。本研究根据中药复方君臣佐使配伍原则，通过综合分析予以各指标权重系数，计算综合评分，避免单一因素对中药复方提取工艺筛选的局限性和片面性，为进一步优化复方益肾利石颗粒提取制备工艺提供了科学的实验依据。

表9 综合评分方差分析表