打顶方式对雪茄烟烟叶氮素积累及品质的影响

张思唯 李金奥,2 刘博远 蒋雨辰 钟 秋 雷云康 张明月 赵铭钦

（1河南农业大学烟草学院/河南省香精香料与调香工程技术研究中心，450002，河南郑州；2红云红河集团昆明卷烟厂，650000，云南昆明；3四川省烟草公司德阳市公司，618400，四川德阳）

雪茄烟作为一种特殊的卷烟产品，具有劲头大、香气浓郁和吃味醇厚等特点。由于其抽吸方式与烤烟不同，所以对人体危害较小，近几年发展较快[1]。而随着雪茄烟销售规模的增大，国内优质雪茄烟原料质量不足，严重制约了雪茄烟产业的发展。四川什邡是我国雪茄烟的主产地之一，其生态条件与国外优质雪茄烟产区较为接近，但由于发展起步较晚，尚未形成成熟完备的雪茄烟栽培技术规程。在日常栽培管理中，当地经常采用扣心和现蕾打顶的打顶方式，导致当地雪茄烟叶片偏大，氮素积累过多，蛋白质和烟碱含量升高，烟叶吸食品质变差。雪茄烟属于高氮类型的烟草，含氮化合物的合成和转化对其质量和产量有明显影响[2]，而烟株打顶是烟草栽培中一项重要的技术措施，可及时调整烟株的养分供应，使光合产物向烟叶内部集中分配，促进烟叶内部干物质积累，增加烟叶有效叶面积[3]，影响烟叶中总氮、蛋白质和烟碱等主要化学成分的合成与积累[4]。

氮代谢是烟草生长发育中的关键代谢之一，其代谢强度和协调程度会对烟叶品质形成起到重要的调节作用，并最终影响烟叶质量。许威等[5]研究表明，打顶会使烟株充分吸收氮素，用于合成烟碱，导致其烟碱合成能力增强。赵光伟等[6]研究表明，随着打顶时间的推迟，烟叶内糖含量变化呈先上升后下降趋势。目前，国内外对烟叶打顶技术的研究主要集中在其对化学成分和产量的影响，对打顶后烟叶内部氮素积累规律和相关酶活性影响的研究几乎没有。因此，本试验以四川什邡烟区的德雪3号为试验材料，研究了不同打顶方式对雪茄烟烟叶打顶后氮代谢关键酶活性、烟碱含量、化学成分以及感官品质的影响，探讨打顶引发的烟株内部氮素积累机制，探究什邡烟区最适宜的打顶方式，为该地区优质雪茄烟烟叶生产提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及材料

试验于2020年在四川省什邡市师古镇大泉坑村雪茄烟生产基地（104°09′ E，31°18′ N）进行，供试品种为德雪3号。试验地土壤为水稻土，土壤pH 5.8～7.0、有机质3.01g/kg、速效磷38.10mg/kg、速效氮120mg/kg、速效钾89mg/kg。

1.2 试验设计

烟苗于 2020年 4月 30日移栽，行株距为120cm×40cm，施氮量为180kg/hm2（烟草专用复合肥，N:P2O5:K2O＝1:0.5:3），共设3个处理，选取田间长势一致的烟株，分别于现蕾期、初花期和盛花期打顶，分别记为T1、T2和T3处理，打顶时间分别为6月9日、6月12日和6月16日。试验采用随机区组排列，3次重复。各处理分别在打顶后0、5、10、15和20d取中部叶位（自下而上10～12叶位）叶片20片，一部分于液氮罐保存，用于测定氮代谢关键酶活性，一部分去除主脉后于105℃烘箱杀青15min，65℃烘干至恒重，将其磨碎过60目筛，用于测定烟碱、总氮、蛋白质及常规化学成分含量。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 氮代谢相关酶活性 采用苏州科铭生物试剂盒，利用紫外分光光度法检测硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）、谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）的活性。

1.3.2 化学成分及氨基酸含量 按照流动分析仪法[7]测定总糖、总氮、烟碱和蛋白质含量。采用苏州科铭生物试剂盒，利用紫外分光光度法检测氨基酸含量。

1.3.3 烟叶感官质量评价 将各处理调制后的中部叶卷成单料雪茄烟，请评吸专家根据YC/T 138-1998的方法进行感官质量评价。

1.4 数据分析与作图

采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，利用SPSS 24.0进行差异显著性分析，利用 GraphPad Prism 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对氮代谢关键酶活性的影响

NR是植物将体内的硝态氮转化为氨态氮的关键酶，对植物氮代谢起关键作用。由图 1a可以看出，雪茄烟NR活性随着打顶后天数的增加呈先上升后下降趋势，打顶当天T1处理酶活性显著高于T2和T3处理，各处理均在打顶后5d时达到峰值，这表明雪茄烟在打顶后由于根系吸收氮素能力增强，氮代谢能力增强。打顶后5d时T2处理显著高于T3处理，之后各处理雪茄烟叶酶活性逐渐下降，在打顶后20d酶活性降到最低，且T2处理显著低于T1处理，表明雪茄烟在成熟期氮代谢逐渐减弱，烟株由氮代谢向碳代谢转化，利于烟叶后期生长发育。

GS是氨同化的关键酶，是植物氮素同化中重要的酶之一。由图1b可以看出，雪茄烟GS活性随着打顶后天数的增加呈先下降再上升再下降趋势，T1处理在打顶刚开始时酶活性最高，且显著高于T2和T3处理，随后剧烈下降，可能是由于过早打顶导致，之后各处理GS活性缓慢下降，且T1处理一直高于T2和T3处理，在打顶后15d时，GS活性缓慢上升，各处理间差异不显著，在打顶后20d时，各处理酶活性整体下降，可能因为烟叶进入成熟衰老期，导致酶活性整体下降。

GOGAT与GS共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。由图 1c可以看出，不同处理烟叶的GOGAT活性随着打顶后天数的增加呈先上升后下降趋势，与NR活性变化趋势一致，表明烟株在打顶初期氮代谢旺盛，随着打顶后天数的增加，氮代谢减弱，碳积累增强。烟株在打顶当天T1处理GOGAT活性显著高于T3处理，与T2处理差异不显著，在打顶后5d时，T2处理GOGAT活性最高，且与T1和T3处理差异显著，之后T1处理酶活性一直处于较高水平，T2和 T3处理酶活性较低，可能由于T2和T3处理打顶较晚，烟株较T1处理田间密度小，导致烟叶光合作用增强，氮素积累更多向碳素积累转化。

图1 不同处理对雪茄烟叶NR、GS和GOGAT活性的影响Fig.1 The effects of different treatments on the activities of NR, GS, and GOGAT in cigar tobacco leaves

2.2 不同处理对雪茄烟烟叶总氮、氨基酸、蛋白质和烟碱含量的影响

由图 2a可以看出，雪茄烟在打顶后各处理总氮含量均呈现缓慢下降趋势，在打顶0～5d时，T1处理烟叶总氮含量一直显著高于T2和T3处理，打顶后15～20d，各处理间无显著差异，可能是因为叶片干物质积累造成烟叶稀释效应，导致烟叶总氮含量下降。

由图 2b可以看出，雪茄烟打顶后氨基酸含量变化趋势与NR活性变化一致，呈先上升再逐渐下降趋势。打顶后5d烟叶氨基酸含量最高，表现为T2＞T1＞T3，T2与T3处理间差异显著，与T1处理差异不显著。之后随打顶后天数增加，烟叶逐渐成熟，导致氨基酸含量逐渐下降。在打顶后10～20d，T1处理氨基酸含量始终显著高于T2和T3处理，T2和T3处理间差异不显著。

由图 2c可以看出，蛋白质含量在打顶后随着烟叶生长天数增加呈缓慢下降趋势，打顶后 0～5d时，T2处理降幅最大，为9.17%，之后随着打顶后天数的增加逐渐趋于平缓，其中T2处理一直显著高于T1和T3处理。在打顶后20d时，烟叶蛋白质含量降到最低，蛋白质含量为 T1＞T2＞T3，分别为16.03%、15.78%和14.81%，T1和T2处理间无显著差异，但显著高于T3处理。

由图 2d可以看出，雪茄烟烟碱含量随打顶后天数的增加而逐渐增加，在打顶后0～5d，T1处理涨幅最大，为44.9%，其次为T3和T2处理，分别为36.4%和24.3%，这是因为较早打顶和较晚打顶都会导致雪茄烟烟碱急剧增加。打顶后10d时，T2和T3处理显著高于T1处理，打顶后20d时，T3处理烟碱积累量最多，达3.39%，T2处理次之，T1处理最低，且T1处理显著低于T2和T3处理，T2和T3处理间差异不显著，这可能是因为较早打顶导致雪茄烟氮素积累不足，从而烟碱积累较少。打顶过晚氮素由根部向顶部运输，从而导致烟碱积累量上升。

图2 不同处理对雪茄烟叶总氮、氨基酸、蛋白质和烟碱含量的影响Fig.2 The effects of different treatments on the contents of total nitrogen, amino acid,protein and nicotine in cigar tobacco leaves

2.3 不同处理对调制后雪茄烟烟叶化学成分含量的影响

由表1可知，随着打顶时间的推迟，调制后雪茄烟的总糖含量呈逐渐下降趋势，且T1和T2处理显著高于T3处理，烟碱含量随打顶时间的推迟呈先上升后下降变化趋势，T2与 T1处理间差异显著。蛋白质含量随打顶时间的推迟逐渐下降。韩富根[8]指出，烟草的钾氯比大于4的情况下，燃烧性较好，本研究中T2处理钾氯比高于T1和 T3处理。氮碱比在接近1的情况下烟叶质量较好，若氮碱比增大，烟叶颜色变浅，香味减少[8]，T2处理最接近1，且与T1处理差异显著。综合来看，T2处理的化学成分最协调。

表1 不同处理对雪茄烟常规化学成分的影响Table 1 Effects of different treatments on the conventional chemical composition of cigar tobacco

2.4 不同处理对雪茄烟叶感官质量的影响

由表2可知，雪茄烟叶的香气质、香气量、劲头、浓度、余味、甜度和灰色等指标分值都随着打顶时间的推迟呈先上升后下降的趋势，刺激性、杂气和燃烧性等指标分值逐渐降低，T2处理的总分最高，说明T2处理感官品质相对其他处理较好，总体香气质好，香气量足，燃烧性好，其次是T3处理感官品质较好。

表2 不同处理对雪茄烟叶感官质量的影响Table 2 Effects of different treatments on the sensory quality of cigar leaves

3 讨论

3.1 打顶方式对烟叶氮代谢酶活性的影响

在烟株的生长过程中，氮代谢的动态变化对烟叶品质影响较大，通过打顶可以调节烟株的生长中心，调整养分供应，调整烟叶的株高、节距和留叶数，进而改变烟田内的温度和光照强度，从而影响烟叶的碳氮代谢强度，影响烟叶内部的氮素积累。在烟株的生长前期，氮代谢旺盛有利于为优质烟叶的形成提供丰厚的物质基础，NR和GS是烟叶氮代谢的关键酶，在烟株生长发育过程中起主要调节作用[9]，增强其活性可促进烟株内部氨基酸的合成与转化[10]，也有利于根系对氮素营养的吸收与利用[11]。在本文研究中，NR与GOGAT活性变化趋势一致，均呈先上升后下降的趋势，打顶后先上升是由于烟叶在打顶后根系吸收氮素能力增强，氮代谢能力增强，出现下降趋势是由于烟叶进入成熟衰老期后，整体酶活性减弱，其中T2处理在打顶初期NR和GOGAT活性较低，在打顶后5d时上升到最高，可能是适当延长打顶时间可提高烟叶代谢能力，使烟叶酶活性上升，之后逐渐下降，且酶活性低于其他处理，说明T2处理的烟叶淀粉积累代谢增强，烟叶较其他处理品质提高。这与张嘉雯等[12]在植烟密度对雪茄烟叶碳氮代谢的影响上研究一致。GS活性在打顶后呈先下降后上升再下降趋势，这与曾孝敏[13]在施氮量对烤烟碳氮代谢过程中关键酶及代谢产物的影响上研究规律不同，前期GS活性下降可能与烟叶在打顶后NH4+增多，促使GS将其合成为谷氨酸（Gln），但Gln浓度增加会抑制GS活性。T2处理酶活性一直处于较低水平，说明过早或过晚打顶可使烟株对 NH4+同化能力增强，GS活性增强。

3.2 打顶方式对烟叶生长发育过程中总氮、氨基酸、蛋白质和烟碱含量的影响

总氮和蛋白质是烟叶在生长发育过程中维持机体生命活力的主要物质基础。在本研究中，烟叶的总氮和蛋白质含量呈直线下降趋势，可能是由于合成的一部分碳水化合物和烟叶内部氮素结合使得供给烟株的营养暴增，烟株生长的骨架物质充足，因此由于碳水化合物的增加，烟叶含氮化物含量就相对减少[14]。其中T2和T3处理总氮含量相对较低，说明适当推迟打顶可以降低叶片的氮素浓度，对烟叶的成熟有一定促进作用。T2处理蛋白质含量一直显著高于T3处理，说明过晚打顶不利于烟叶内部蛋白质合成。

游离氨基酸含量对研究植物在不同条件下及不同生长发育时期氮代谢变化、植物对氮素的吸收、运输、同化及营养状况等具有重要意义[15]，在本研究中不同打顶方式下，氨基酸含量变化与氮代谢主要酶NR活性变化趋势一致，主要因为NR可促进烟株内游离氨基酸的合成与转化，经T2处理，烟叶氨基酸含量由刚开始较高水平降低到较低水平，这是由于较晚打顶的烟株在烟田中的密度比早打顶的烟株密度小，烟株节距增大，因此导致烟叶光合速率增强，光合产物增多。

烟碱经烟株根系合成后又重新运输到叶片中去。在本研究中，烟叶在打顶处理后，烟碱含量呈缓慢上升趋势，这可能是由于烟株经过打顶后，顶端库对养分的需求被消除，烟株根系由原来的源变为库，大量光合产物会通过韧皮部传递给烟株根系，促进根系的二次生长，大量根系将合成的烟碱输送给烟叶。这与张丹等[16]在打顶时期对烤烟根系活力及烟碱积累规律的影响研究一致。其中T3和T2处理烟碱含量一直明显高于T1处理，T1处理烟碱合成量一直较低，可能是由于打顶后烟株过早吸收土壤中的氮素，转化为供给烟株生长的营养物质，导致烟碱在叶片中没有得到有效积累[17]。

3.3 打顶方式对烟叶调制后化学成分的影响

不同的打顶方式在影响烟叶氮代谢进程的同时也会影响烟叶中的化学成分[12]。调制后烟叶的糖含量对雪茄烟的香吃味具有重要影响，糖碱比较适宜，烟气醇和，有利于提高烟叶的内在品质[18]。综合分析印尼和中国海南等地的烟叶化学成分含量可知，优质雪茄烟中部叶的总糖含量约 2%、总氮含量4%～6%、烟碱含量1%～2%、钾含量≥2%、钾氯比≥4[19]。烟叶中淀粉含量过高会导致烟叶燃烧产生杂气，使抽吸时香吃味变差。蛋白质含量较高时，烟气强度较大，香吃味变差，具有刺激性及辛辣味。烟叶的钾氯比维持在≥4、氮碱比维持在1左右的条件下烟叶品质较好[8]。本试验研究表明，T1处理总糖和还原糖含量最高，但明显低于优质烟叶糖含量，这主要因为晾制时间过长，在晾制过程中糖经过烟叶的呼吸作用被消耗[18]，T2处理烟碱含量较T1和T3处理高，这与伍发明等[20]在打顶期对湖北恩施烟区雪茄烟品种产质量的影响研究结果不一致，可能是因为在烟株经T1处理前期，当地雨水较多，导致烟株茎叶生长旺盛，烟叶细胞间隙较大，组织疏松，使调制后烟碱含量相对较低。T2处理的钾氯比最高，说明烟叶的燃烧性最好；氮碱比最接近1，说明烟叶的香味较多，刺激性较小，吃味醇和，这与董维杰等[21]的研究结果一致。

3.4 打顶方式对调制后烟叶感官质量的影响

烟叶的感官质量是评价优质雪茄烟的关键因素，本研究中不同处理烟叶的香气质、香气量、劲头、浓度、余味、甜度和灰色等指标分值都随着打顶时间的推迟呈先上升后下降的趋势，可能是现蕾期打顶烟株营养供应充足，叶片发育较大，较初花期和盛花期打顶烟田内密度较大，烟叶呼吸作用减慢，感官质量下降。

4 结论

不同打顶方式对雪茄烟叶氮代谢关键酶活性、烟碱、氨基酸及相关化学成分含量都有显著影响，初花期打顶的烟叶氮代谢酶活性由刚开始较高到烟叶成熟后期下降到最低，说明烟叶在成熟后期氮代谢稳定向碳代谢转化，烟碱含量在打顶后逐渐上升，初花期和盛花期打顶烟碱积累量较多，同时初花期打顶的烟叶在晾制后的化学成分也较其他处理协调，感官质量评价较好，因此雪茄烟在四川省什邡市种植时应以初花期打顶为宜，盛花期次之。