一株高效烟碱降解菌的筛选及其在烟草烘烤中的应用

郭青青，许天驰，杨春雷，孙光伟，杨久红，余 君，杨 勇*

(1.湖北大学生命科学学院，湖北武汉 430062；2.湖北省烟草科学研究院，湖北武汉 430030)

烟碱又名尼古丁，分子式CHN，是烟草中的主要生物碱，是烟草和卷烟质量评价的重要因素。烟碱是吸烟成瘾的关键成分，且对人体也有一定程度的损伤。如高淑芳等研究表明，烟碱可以轻易穿过血脑屏障和生物膜对人体造成影响，尤其是当妇女处在妊娠期时，会导致新生儿易患病，神经和智力发育也会受阻。同时，随着烟草制品的大量生产和消费，包括烟碱、氨基联苯、萘胺、苯并(a)芘等有毒物质在内的烟草废弃物进入了环境，这些有害物质无法回收利用，已经产生严重的环境问题。当烟碱含量超过0.05%()时，这些废物被欧盟规定为有毒有害物质。如果处理不当，这些废物可能损害人类健康和环境。数据显示，生产1 t卷烟需要排放60 t以上烟草废水，且我国烟草制品中普遍存在烟碱含量过高的问题，因此对于环境和烟草制品中的烟碱降解是非常有必要的。

目前对于烟碱的降解主要集中在生物处理方面，与物理、化学处理方法相比，微生物降解菌在成本、效率和可持续性方面都具有优势。在生物降解烟碱的方法中，主要报道的烟碱降解菌多属于假单胞菌属()、节杆菌属()、苍白杆菌属()、农杆菌属()。Wang等从烟草根际土壤中分离出一种高效降解的菌株sp.strain S33，它能在最优的培养条件下将1 g/L烟碱在6 h内完全降解；张娟从湖南省的烟草土壤中筛得菌株ND，可在2 d内将1 g/L液体培养基中的烟碱降解70.40%。截至目前，有关烟碱降解菌的研究工作尚处于筛选过程，较少地应用到烟草制品及废弃物的降解上。该研究从湖北恩施多年连作的烟田中分离得到一株能够高效降解烟碱的菌株，并对菌株的降解能力进行测定，优化其培养环境，并尝试应用于烟草烘烤过程中，其研究成果不仅可以丰富降解菌株资源，并为降解菌应用于烟草实际生产中提供参考价值。

1 材料与方法

土壤来源。筛选高效烟碱降解菌的土壤样本来自湖北恩施的烟草种植区。

培养基。LB培养基：每1 000 mL蒸馏水加NaCl 10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，pH为7.0，于115 ℃灭菌20 min。基础盐培养基(MSM)：每1 000 mL蒸馏水加(NH)SO2 g、MgSO0.2 g、CaCl·HO 0.01 g、FeSO0.001 g、NaHPO·12HO 1.5 g、KHPO1.5 g，pH为7.0，于115 ℃灭菌20 min。

试剂。烟碱标准品(HPLC>99%)，购自安徽酷尔生物工程有限公司；甲醇色谱级(质量分数≥99%)，购自阿拉丁公司；其他试剂均为AR级试剂。

降解菌的筛选。将收集的土壤分别取10 g，放于90 mL灭菌去离子水中，180 r/min振荡过夜获得菌悬液。吸取10 mL的菌悬液接种到烟碱浓度为1 g/L的LB液体培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养3 d后再吸取菌悬液100 μL进行第二次驯化，如此循环3次，参考文献[11]进行驯化。从终浓度的培养基中吸取菌悬液100 μL接种到烟碱浓度为1 g/L的基础盐培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养2 d后，随后吸取菌悬液100 μL接种到烟碱浓度为2 g/L的基础盐培养基中，温度37 ℃，230 r/min培养2 d，依次传代接种至烟碱浓度为5 g/L的基础盐培养基，取最后一次的菌悬液100 μL 涂布LB固体培养基中，反复纯化多次分离，挑选形态鲜明、菌落清晰的不同单菌落。将不同形态特征的单菌落采用甘油保存方式，保存于-80 ℃的超低温冰箱中，备后续试验所用。

菌种鉴定。形态结构观察及生理生化试验参照文献《常见细菌系统鉴定手册》进行。

分子生物学鉴定：通过DNA提取试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)得到目标菌株的基因组，进行PCR扩增。反应体系：DNA模板5 μL，正反向引物各1 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，10×Extaq buffer 5 μL，Extaq 1 μL，加ddHO补足体系至50 μL。引物序列：27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；扩增程序：94 ℃预变形3 min；94 ℃变形1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存30 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小为1 450 bp左右，并与GenBank中的16S rRNA序列进行比对。

培养条件对菌株降解能力的影响。在LB固体培养基平板上进行降解菌株的活化，并转移到LB液体培养基中作为种子液，检测单因子条件下降解菌株降解能力。①温度的影响。将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，pH为7.0，不同温度(28、37、45 ℃)，230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况。②初始pH的影响。将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、8.0)下，温度37 ℃，230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况。③接种量的影响。将降解菌种子液以不同接种量(1%、2%、3%、4%)接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的浓度为2 g/L，pH为7.0，温度37 ℃，230 r/min培养36 h，每12 h取样一次，利用HPLC检测其降解情况,降解率=(CK组峰面积-降解菌组峰面积)/CK组峰面积×100%。

培养条件对菌株生长的影响。探究影响菌株生长的碳源(葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麦芽糖)、氮源(蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏和玉米浆干粉)和无机氮源(醋酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠)对降解菌株的生长影响；将降解菌种子液以2%的接种量接种到以烟碱为唯一碳源的MSM培养基中，烟碱的初始浓度为2 g/L，pH为7.0，温度37 ℃，230 r/min培养12 h，每2 h取样一次，用紫外分光光度计测定600 nm处的OD值，共6次。在MSM培养基中分别加入1、2、3、4、5、6 g/L烟碱，菌株P3a接种量为2%，每12 h采集一次，共5次，同样用紫外可见分光光度计测定600 nm处的OD值。

烟叶烘烤过程中降解菌的降解能力。在烟叶固化前，利用降解菌株降低烟碱含量。利用优化后的培养基培养菌株24 h，将发酵液离心浓缩蒸馏至浓度为5×10CFU/mL。最后，对每1 kg新鲜烟叶喷洒100 mL的细菌溶液，而对照组的蒸馏水用量相同。采用GB/T 23225—2008分光光度法测定烟叶烟气固化后的烟碱含量。

菌株生物量的测定。用紫外分光光度计测定600 nm处OD值，则为菌株的生物量。有效检测范围为0～0.8，如果数值超过该范围，则需要进行样品稀释。

菌株降解率的检测。所有样品的烟碱浓度均采用C(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱检测(HPLC)。流动相为甲醇∶ 1 mmol/L硫酸=25∶75；流速0.6 mL/min；注入量20 μL；波长259 nm；温度30 ℃。发酵液每6 h取样一次，12 000 r/min离心10 min。然后在4 ℃处沉积取上清液。发酵过程完成后，用0.05 mol/L盐酸稀释20倍，最后用0.22 μm的滤膜过滤，用HPLC测定。

烟碱脱氢酶活性的检测。将降解菌接种于LB液体培养基中，优化发酵培养。摇瓶发酵12 h后收集细菌，细菌缓冲悬液超声破裂，用紫外分光光度计测定576 nm处OD值。

采用SPSS 19.0软件和Excel进行数据的描述统计分析。

2 结果与分析

分离出1株以烟碱为碳源和氮源的菌株，命名为P3a。采用高效液相色谱法(HPLC)检测了P3a和原有降解菌EA-17对初始浓度为2 g/L 烟碱的降解情况。结果表明(表1)，P3a在24 h对烟碱的降解率为70.03%，36 h为99.06%；EA-17在24 h对烟碱的降解率为54.14%，36 h为97.87%，P3a的降解能力较高于EA-17。

菌株P3a在LB固体培养基上的形态：菌落呈圆形，柠檬黄不透明，表面光滑，无晕环，无凸起(图1a)。通过PCR的16S rRNA序列测定，并经Blast程序比对，发现菌株P3a与节杆菌sp.AD7(JF775581.1)的相似度为99%，表明菌株P3a为节杆菌属，故命名为节杆菌P3a(sp.P3a)，并且在构建的系统发育树中，菌株P3a也与sp.处于同一分支(图1b)。同时，菌株P3a的16S rDNA的测序结果已上传到GenBank数据库，注册登录号为MK342527.1。

表1 不同菌株对烟碱降解峰的统计学结果Table 1 Statistical results of nicotine degradation peaks of different strains

烟碱标准曲线和sp.P3a的生物量。通过紫外分光光度计测定OD获得了菌株P3a生长状态，P3a的指数期为6～10 h，16 h后生物量没有明显变化，菌株P3a的最大生物量出现在12 h时，此时降解速率最为明显(图2)。

在烟碱的初始浓度为2 g/L，加入菌株P3a种子液的降解发酵液随着发酵过程的变化而出现颜色变化，发酵溶液的颜色在12 h时为蓝色，36 h为深蓝色，48 h接近黑色，后转为褐色，最后是浅褐色；推测是在发酵过程中产生了几种代谢物(图3)。

图1 Arthrobacter sp.P3a的平板菌落(a)和系统发育树(b)Fig.1 Plate colony (a) and phylogenetic tree (b) of Arthrobacter sp.P3a

图2 降解菌株P3a 22 h内的生物量变化Fig.2 Biomass changes of degraded strain P3a in 22 hours

不同条件下sp.P3a的烟碱降解率。通过HPLC检测得到，在烟碱的浓度为2 g/L、pH为7.0、温度37 ℃、230 r/min的条件下，菌株P3a在12 h的降解率达到36.45%，24 h的降解率达到70.03%，36 h的降解率高达99.06%(图4)。通过HPLC检测得到，当pH为7.0时，烟碱的降解效果最好，在pH为5.5和8.0时，烟碱的降解率较低，因此，菌株P3a对烟碱降解的适应性pH为6.5～7.0(图5a)。图5b显示，菌株P3a在45 ℃时不能生长，在28和37 ℃降解36 h时，降解率基本相同，但在12～24 h 28 ℃比37 ℃条件下降解率高。因此，P3a降解烟碱的最佳温度为28 ℃。图5c显示，当接种量为1%时，其接种速度明显慢于其他3种接种量；其余3种接种量的降解率相似，其中4%略高于3%和2%。因此，当接种量为2%时，就足以降解2 g/L的烟碱。

图3 烟碱降解发酵液的颜色变化情况Fig.3 Color change of the fermentation liquid of the nicotinic acid

图4 36 h菌株P3a的降解率情况Fig.4 Degradation rate of strain P3a at 36 h

不同培养条件下sp.P3a的生物量。以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麦芽糖作为碳源(1%)，与无碳源的空白对照(CK)相比，所有碳源都能促进菌株P3a的生长；当以葡萄糖为碳源时，该菌株的生长条件最好，因此选择其作为发酵培养的碳源(图6a)。进一步的试验分析表明，8.5 g/L葡萄糖是最佳含量。以蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏和玉米浆干粉作为有机氮源(0.5%)，当添加玉米浆干粉时，P3a的生物量最大，因此在发酵培养中采用玉米浆干粉作为有机氮源(图6b)。进一步分析表明，采用2.5%玉米浆干粉可达到有机氮的最佳浓度。在发酵培养基中分别加入醋酸铵、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵和硝酸钠作为无机氮源(0.05 mol/L)，与CK组相比，无机氮源对菌株P3a的生长没有显著影响；在这几种无机氮源中，硝酸铵的添加使得菌株P3a的生物量相对最大，因此，选择硝酸铵作为无机氮源(图6c)。

由图6d可知，低浓度的烟碱(1～2 g/L)菌株P3a的长势很好，在烟碱浓度较高的情况下，长势较为缓慢，在5 g/L烟碱作用下仍能良好生长，6 g/L烟碱会抑制P3a的生长。由此可见，菌株P3a对烟碱的耐受性很高，能承受较高浓度烟碱的环境，在烟碱降解的实际应用中能很好发挥生物性能。

图5 pH(a)、温度(b)和接种量(c)对菌株P3a烟碱降解的影响Fig.5 Effects of pH (a),temperature (b) and inoculum size (c) on nicotine degradation of strain P3a

注：a.不同碳源；b.不同有机氮源；c.不同无机氮源；d.不同浓度烟碱 Note:a.Different carbon sources;b.Different organic nitrogen sources;c.Different inorganic nitrogen sources;d.Different concentrations of nicotine图6 不同培养条件下菌株P3a生物量变化Fig.6 Biomass changes of strain P3a under different culture conditions

将P3a和EA-17分别接种于基础盐培养基、LB培养基和最优培养基中发酵培养，结果表明(图7)，LB培养基中尼古丁脱氢酶的平均活性为3.12±0.41，最优培养基的平均活性为9.01±0.63，其中菌株P3a的尼古丁脱氢酶活性高于菌株EA-17。

采用GB/T 23225—2008分光光度法测定烟叶烟气固化后的烟碱含量，结果表明(表2)，菌株P3a对烟碱的降解率明显高于空白对照，降解率达到55.11%。

3 讨论与结论

从烟田土壤中分离到1株能够利用烟碱作为唯一碳源和氮源的菌株sp.P3a，经菌种鉴定为节杆菌属。近年来，烟碱降解菌的报道很多，有些菌属的降解途径已比较明确，特别是节杆菌属。节杆菌属的降解途径是吡啶途径，即先从吡啶环的羟基化开始，经一系列的酶促反应最终生成2,3,6-三羟基吡啶进入三羧酸(TCA)循环，同时产生蓝色素，该途径的第一步是烟碱在尼古丁脱氢酶的催化下开始的。在整个途径中产生了几种酶，如尼古丁脱氢酶、6-羟基-1-尼古丁氧化酶和酮脱氢酶。因此，也不难理解培养液的颜色变化，以及P3a的尼古丁脱氢酶的活性高于EA-17，高达9.01。

图7 不同培养基下菌株P3a和EA-17的尼古丁脱氢酶活性Fig.7 Nicotine dehydrogenase activities of strains P3a and EA-17 in different media

表2 菌株P3a对烟叶烘烤过程中烟碱降解的影响Table 2 Effects of strain P3a on nicotine degradation during tobacco baking %

sp.P3a能在37 ℃、pH 7.0的条件下，将初始浓度为2 g/L烟碱作为唯一碳源和氮源，在培养36 h内可降解99.06%的烟碱。且探究了该菌株的最优培养条件，即在以葡萄糖作为碳源，以玉米浆干粉为有机碳源，以硫酸铵为无机氮源时，菌株P3a最佳pH为6.5～7.0，与假单胞菌属HF-1和节杆菌aRF-1相似；最适生长温度为28 ℃，与米曲霉112822相似。P3a能在烟碱浓度为5 g/L的情况下良好生长，相比苍白杆菌SJY1(3.0 g/L)和假单胞菌HF-1(2.0 g/L)的烟碱耐受性，P3a有很强的耐受性。并将它应用到新鲜的烟叶中，发现它可以减少1 kg新鲜烟叶中55.11%的烟碱;鉴于其对烟碱的降解能力很强，可高效地应用于环境和烟草废弃物中的烟碱降解。