基于叶绿素荧光的小麦越冬期冻害评价

杨 程 杜思梦 张德奇 时艳华 李向东 邵运辉 方保停 王汉芳

（河南省农业科学院小麦研究所/小麦国家工程实验室/农业农村部黄淮中部小麦生物学与遗传育种重点实验室/农业农村部中原地区作物栽培科学观测实验站/河南省小麦生物学重点实验室，450000，河南郑州）

小麦是我国第二大粮食作物，河南省小麦种植面积约占全国小麦种植面积的 1/5，产量约占全国小麦总产量的1/4[1]，因此，河南省小麦的稳产和丰产对我国粮食安全具有重要意义。

小麦与水稻、玉米相比生育期更长，在黄淮海麦区从10月一直持续到次年6月。漫长的生育期也意味着遭受各种自然灾害和逆境胁迫的机率增大，包括低温冻害[2]、干旱[3]、阴雨寡照[4]、高温[5]和干热风[6]等，其中低温冻害是危害最严重的自然灾害之一，由于全球生态环境的破坏和气候变暖加剧，近年来异常气候频发，小麦遭受低温冻害的风险也逐渐增高[7]。低温不仅能够通过降低叶片实际光化学效率和光合速率，降低小麦干物质积累，进一步导致产量下降[8-9]，而且也会直接影响小花分化过程而导致穗粒数降低，从而影响产量[10]。此外，低温还可以通过氧化压力抑制小麦幼根的生长并导致其死亡[11]。合适的抗寒性评价指标无论是对小麦低温逆境生理研究还是对实际生产中小麦抗寒栽培管理和抗寒育种都十分重要。

目前，评价小麦低温抗寒性的指标主要有以下几种，形态学指标，通过田间自然低温或者人工模拟低温处理，调查小麦的存活率、死茎率或冻害等级等形态学指标来评价小麦抗寒性[2,12-14]；利用电导率结合Logist方程求拐点温度，通过确定植物组织的低温半致死温度，评价小麦低温抗寒性[14-17]；低温胁迫下，通过测定可溶性糖、游离脯氨酸、膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）等的含量和抗氧化酶活性来鉴定小麦的抗寒性[18-20]。通过光合速率、蒸腾速率、气孔导度、胞间二氧化碳浓度和最大光化学效率（Fv/Fm）等生理指标反映品种抗寒性[21]。以上方法在小麦抗寒性研究中均有应用，调查形态学指标（如冻死率、死茎率）仅适用于极端低温条件下，而测定电导率和酶活性等方法需要通过破坏性取样来实现，虽然通过光合仪测定光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度可以实现田间和室内条件下的无损伤测定，但是在田间测定过程中需要晴天且无风等条件，所以在实际应用过程中均有一定的局限性。测定Fv/Fm来反映叶片抗寒性具备无损伤和快速高效等优点，但是该指标的准确度和对低温的敏感度等尚没有充分的试验验证。

叶绿素荧光诱导动力学曲线蕴含着丰富的光合作用的相关信息，是无损测定叶片光合性能的常用手段。植物光合机构对逆境胁迫非常敏感，干旱[22]、低温[23]、高温[24]和盐[25]等胁迫都会导致光合作用的下降和叶绿素荧光诱导曲线的改变。因此，本研究通过分析33个小麦品种越冬期冻害的形态指标与包括Fv/Fm在内的 34个常用叶绿素荧光诱导动力学参数的相关性，验证这些参数与小麦冻害的相关性并筛选能够反映小麦冻害程度的更优指标，为小麦越冬期田间管理和抗寒育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料种植和田间管理

选用1941-2014年通过审定的33个冬小麦品种（表1）种植于河南省平原新区（新乡市原阳县）河南省农业科学院实验基地，小区面积6m2，试验田块肥力较高，地力均匀度好，按照大田生产实际整地，2016年 10月 5日播种，株距 2cm，行距20cm，通过人工点播保证均匀度一致，通过合理水肥管理保证整个生育期水肥充足。

表1 供试小麦品种Table 1 The wheat varieties tested

1.2 越冬期小麦生长指标和冻害情况调查

指标调查时间为2016年12月15日，每个品种从田间随机选取5株，分别调查叶龄、株高、单株分蘖数、单株叶片数和发生冻害叶片数。小麦越冬期冻害主要表现为叶片干黄[26-27]，多数发生在叶尖部位，单个叶片冻伤面积超过10%即视为冻伤叶片，通过调查叶片冻伤率来反映小麦田间冻害情况，叶片冻伤率=单株冻伤叶片数/单株叶片总数。

1.3 叶绿素荧光参数测定

叶片先暗适应 20min，然后利用 M-PEA（Hansatech，英国）测定叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（O-J-I-P曲线），测定位置为小麦最新完全展开叶的中间部位，每个品种测定5次。O-JI-P曲线由 5000μmol/(m2·s)的脉冲光诱导，荧光信号记录从10μs开始至2s结束，记录的初始速率为每秒105个数据。用JIP-test分析O-J-I-P曲线，计算荧光参数[28-30]（表2）。

表2 O-J-I-P曲线参数及计算公式Table 2 Parameters and formula of O-J-I-P curve

1.4 数据处理

使用Microsoft Office 2019和 SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 越冬期气候条件

2016-2017年度小麦生育期内的温度变化如图1所示，该年度11月份气温下降速度较快，且低温持续时间较长，11月至12月中旬日最低气温≤0℃的天数达到了17d（图2），该气象条件为小麦苗期冻害的发生提供了客观条件。

图1 2016-2017年度小麦生育期温度变化Fig.1 Temperature change during wheat growth period in 2016-2017

图2 2016年11月1日至12月15日日最低气温频率分布图Fig.2 Distribution of daily minimum temperature frequencies from November 1st to December 15th in 2016

2.2 小麦越冬期生长指标和冻害情况

在田间已经可以看到小麦发生了明显的冻害。生长指标调查结果（表3）显示，33个小麦品种株高范围为16.40～31.56cm，单株分蘖数范围为6.00～11.00，单株叶片数范围为16.80～34.40。33个小麦品种的单株受冻叶片数为1.60～8.60。所有品种中叶片冻伤率最高为 0.41，最低为 0.05，变异系数为0.43，表明品种之间对冬季低温冻害的抵抗力有较大差异。通过图3可以看出，所有品种的冻伤率多数集中在0.10～0.20，叶片冻伤率≤0.10和＞0.30的品种较少。

图3 小麦品种叶片冻伤率频率分布直方图Fig.3 Histogram of leaf frostbite rates of wheat varieties

表3 不同小麦品种越冬期冻害调查Table 3 Investigation on freezing damage of different wheat varieties during over winter

续表3 Table 3 (continued)

2.3 小麦叶片冻伤率和生长指标的相关性

小麦的生长状况和冻害发生有密切联系，如图4所示，叶片冻伤率和株高呈显著正相关，而与单株分蘖数呈负相关，而株高越高表明小麦叶片生长速率较快，将更多的物质和能量用于叶片的伸长而不是分蘖数量的增加，同时也导致叶片冻伤率升高。

图4 小麦叶片冻伤率和生长指标的相关性Fig.4 Correlation between leaf frostbite rates and growth indexes of wheat

2.4 叶绿素荧光参数与小麦冻害的相关性

为了建立叶绿素荧光与小麦叶片冻害的联系，计算了常用的34个叶绿素荧光参数（表2），分别与小麦叶片冻伤率进行相关性分析，从中筛选出了相关性最强的 5个正相关参数（TRo/CSm、Fm、ETo/CSm、RC/CSm、Fv/Fm）和2个负相关参数（DIo/RC和 φDo）（表4）。其中，与小麦冻害正相关性最强的参数是TRo/CSm，负相关性最强的是φDo。

表4 与小麦冻伤率相关性最强的7个荧光参数Table 4 Seven fluorescence parameters with the strongest correlation with frostbite rates of wheat

2.5 叶绿素荧光参数与小麦株高的相关性

Fv/Fm是最常用的叶绿素荧光参数，TRo/CSm是筛选出的与小麦叶片冻伤率相关性最强的荧光参数，为了进一步研究小麦越冬期生长、叶绿素荧光参数和小麦冻害之间的关系，分析了株高与叶绿素荧光参数 Fv/Fm、TRo/CSm之间的关系，如图 5所示，小麦株高与Fv/Fm和TRo/CSm均呈显著正相关，相关系数分别为0.459和0.420。

图5 叶绿素荧光参数与小麦株高的相关性Fig.5 Correlation between chlorophyll fluorescence parameters and plant height of wheat

3 讨论

2016年11月后，试验所在地原阳县的气温快速下降，11月至12月15日间有17d最低气温都≤0℃，为小麦冻害发生提供了客观条件。冬小麦在越冬期遭遇冻害的主要形态表现为叶片从叶尖开始黄化和死亡，本研究所选用的33个小麦品种在越冬期的叶片冻伤率为0.05～0.41，基本涵盖了高抗性、中抗性和低温敏感型的完整区间，因此，适用于研究和筛选小麦低温抗性指标。大量研究[31-32]表明，小麦冬季旺长容易导致冻害的发生，在本试验中随着小麦株高的增加，小麦叶片冻伤率也逐渐增加，这与前人研究[31-32]结果相符。

叶绿素荧光诱导动力学曲线蕴含了丰富的光合作用相关的信息，并且具有快速、高效、无损伤等优点。在小麦逆境相关研究中，叶绿素荧光技术也已经被广泛应用，有研究[8]表明，在低温胁迫下，小麦叶片Fv/Fm和光合速率均显著下降，也有研究[21]表明，Fv/Fm可以作为反映小麦抗寒性的指标，在本试验中，Fv/Fm和小麦叶片冻伤率呈显著正相关，表明随着Fv/Fm的升高，冻害程度也呈升高趋势，这与前人研究[21]结果相反，可能是因为前人研究结果是基于少数品种，在人工气候室中结果更易受特异个体的影响，并且不能充分反映实际大田环境[18]，而本试验是基于33个小麦品种，测定过程是在自然越冬期低温冻害发生的情况下进行，更具有代表意义。

TRo/CSm、Fm、ETo/CSm和RC/CSm4个参数与叶片冻伤率呈正相关关系，其中TRo/CSm与冻伤率的相关性最强。该结果表明TRo/CSm可以作为小麦抗寒性指标，且优于其他叶绿素荧光参数。TRo/CSm表示叶片单位面积活性反应中心捕获的光能[29]，在本试验中 TRo/CSm越高的品种叶片受冻越严重。TRo/CSm和 Fv/Fm均与株高呈显著正相关，表明TRo/CSm和Fv/Fm越高，则叶片光合能力也越强，生长速率也越快，从而冻害发生率也越高，因此可以用来评价小麦抗寒性。

4 结论

通过分析越冬期33个小麦品种冻害程度与34个常用的叶绿素荧光诱导动力学参数的相关性，筛选出了正相关参数TRo/CSm，其与小麦叶片冻伤率的相关系数达到0.636，表明TRo/CSm可以作为评价小麦越冬期抗寒性的指标，且优于传统指标Fv/Fm。小麦抗寒性的无损评价方法可以为小麦抗寒生理研究、越冬期田间管理和抗寒育种提供参考。