防腐剂稳定性研究及其在酱牛肉防腐中的应用

余春平，马齐兵，许春芳，童雅琪

（武汉能迈科实业有限公司，湖北武汉 430000）

肉桂酸钾是天然香料肉桂的衍生物，易溶于水、具有广谱的抑菌性[1]，作为一种新型天然防腐剂被广泛应用于医药、农业、饲料、日化和食品等各个领域[2]。pH值呈酸性的果蔬和饮料常使用肉桂酸钾作为香料防腐剂，可以在增加食品风味的同时达到防腐目的[3]。然而，肉桂酸钾在热加工中的应用研究尚少，本文以大肠杆菌和黑曲霉为受试菌，通过菌落计数的方式比较不同pH值和不同温度处理条件下肉桂酸钾与3种传统防腐剂对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌性强弱，并将几种防腐剂应用到酱牛肉保质期研究中，为热加工工业食品添加剂研究提供技术参考，为天然香料防腐剂提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌、黑曲霉，均由武汉能迈科实业有限公司微生物实验室提供；马铃薯葡萄糖琼脂培养基，奥博星生物；LB琼脂培养基，上海博微生物科技有限公司；苯甲酸钠（E211）、双乙酸钠（SDA）、山梨酸钾（E202），均购来自万邦化工；肉桂酸钾，武汉能迈科实业有限公司；冷冻牛肉，亚太中慧；柠檬酸，上海诚心化工有限公司；BBS-DDC超净工作台，欧莱博科学仪器；DGL-35B高压蒸汽灭菌锅，力辰仪器；FA1004电子天平，力辰仪器；DHP-360恒温培养箱，永光明医疗仪器；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，亚荣生化仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化培养

以大肠杆菌为实验菌，按照晏家友等[4]的实验方法活化菌株。

1.2.2 培养基的制备

马铃薯葡萄糖琼脂培养基、LB琼脂培养基根据产品说明书按比例配制。

1.2.3 菌悬液的制备

无菌操作下取适量菌落于100 mL生理盐水中摇匀，得到大肠杆菌与黑曲霉悬液。使用计数板对菌悬液进行计数，将上述菌悬液用无菌生理盐水稀释至 1×105cfu·mL-1备用。

1.2.4 防腐剂溶液的配制

①用生理盐水分别配制浓度为2%的苯甲酸钠、双乙酸钠、山梨酸钾和肉桂酸钾溶液。②使用柠檬酸调节溶液pH值（4.0、4.5、5.0、5.5和6.0）备用。③将防腐剂的生理盐水溶液分别置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃和100 ℃条件下进行热处理30 min，冷却后备用。

1.2.5 检测平板制备

取1 mL菌液与1 mL经不同处理的防腐剂溶液混匀于无菌培养皿中，倾入冷却至45～50 ℃的无菌琼脂培养基，每皿18 mL，使皿中终体积为20 mL，防腐剂终浓度为1‰，以1 mL生理盐水为空白对照，轻轻摇动铺平，冷却凝固后在最适温度下孵育24 h后进行菌落计数。不同处理防腐剂抑菌率计算公式为

式中：I代表抑菌率，%；A代表空白对照组菌落总数，cfu；A0代表实验组菌落总数，cfu。

1.2.6 酱牛肉保质期试验

根据杨艳萍等[5]的实验方法稍有改动制作酱牛肉，在熟制过程中以1‰的浓度加入肉桂酸钾和3种传统防腐剂，制作完成后真空包装置于室温储藏，180 d后观察测定酱牛肉中感官评价指标和微生物指标。

1.2.7 挥发性盐基测定

参照《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228—2016）方法测定酱牛肉中TVB-N。

2 结果与分析

2.1 pH值对防腐剂抑菌性能的影响

肉桂酸钾是肉桂酸的钾盐，在水溶液中肉桂酸根结合H+水解成具有强抑菌性的肉桂酸，因此，在酸性条件下肉桂酸钾对大肠杆菌和黑曲霉具有较好的抑菌性能。由图1可知，当pH值为4.0时肉桂酸钾和山梨酸钾对大肠杆菌的抑菌率可达95%以上，苯甲酸钠和双乙酸钠对大肠杆菌的抑菌率稍低，可达90%；随着pH值的升高，几种防腐剂的抑菌性均有不同程度减弱，当pH值为6.0时，抑菌率均低于50%，其中双乙酸钠的抑菌率最低，此时肉桂酸钾抑菌率在实验组中依然保持最高，约为43%。这说明偏中性条件下无论是天然香料抑菌剂还是传统防腐剂对大肠杆菌的抑菌性均会受到极大影响，其中肉桂酸钾对酸的依赖最小。

图1 pH值对防腐剂抑制大肠杆菌性能的影响

由图2可知，不同防腐剂对黑曲酶抑菌性的影响趋势与大肠杆菌一致。pH值为4.0时各实验组抑菌率均大于90%，随着pH值的升高，几种防腐剂对黑曲霉的抑菌性逐步减弱，其中抑菌性受酸碱度影响最大的是苯甲酸钠，表明苯甲酸钠作为一种酸性防腐剂只有在偏酸性的条件下方可有效抑制黑曲霉。肉桂酸钾对黑曲霉的抑菌作用在pH值为5.0时依然可观，继续调高pH值才会破坏肉桂酸钾抑菌性，当pH值为6.0时，肉桂酸钾对黑曲霉的抑制率超过50%，与山梨酸钾抑菌率相当。

图2 pH值对种防腐剂抑制黑曲霉性能的影响

2.2 温度对防腐剂抑菌性能的影响

食品加工工业中常常会用到热加工的处理方式，然而有的活性物质热稳定性不强，在热胁迫下容易变性失活，极大地限制了防腐剂的使用范围和应用场景。本研究将4种经不同温度处理的防腐剂应用到大肠杆菌和黑曲霉抑菌实验中，实验结果如图3、图4所示。图3中明显可以看出肉桂酸钾对大肠杆菌的抑菌性不随温度变化而变化，当热处理温度升高到100 ℃时肉桂酸钾对大肠杆菌依然保持良好的抑菌性。而其余3种传统防腐剂的防腐抑菌性能在一定程度上均有所减弱，其中以苯甲酸钠抑菌性随温度升高衰减最快，当温度升高到80 ℃，苯甲酸钠对大肠杆菌的抑菌率仅为50%左右。当温度低于60 ℃时，3种防腐剂对大肠杆菌的抑菌性能强弱随温度变化影响不大，但当温度高于80 ℃苯钾酸钠、山梨酸钾以及双乙酸钠对大肠杆菌的抑菌性大幅度减弱，表明在低温热加工过程中4种防腐剂均能保持较好的生物活性，可以极大程度抑制大肠杆菌生长，但是温度一旦高于80 ℃，仅有肉桂酸钾可以保持良好抑菌活性，3种传统防腐剂均不适用于热加工工业中。

图3 不同处理温度对防腐剂抑制大肠杆菌性能的影响

由图4可知，不同处理温度对4种防腐剂抑黑曲霉性能的影响与图3一致。肉桂酸钾的热稳定性极佳，其对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌作用几乎不受处理温度的影响。苯甲酸钠、双乙酸钠和山梨酸钾这3种传统防腐剂在20 ℃低温处理时对黑曲霉的抑菌作用略低于肉桂酸钾，随着温度升高，3种传统防腐剂对黑曲霉的抑菌性逐渐减弱，双乙酸钠在100 ℃时的抑菌率最低。当处理温度为60 ℃时，双乙酸钠对黑曲霉的抑菌率约为50%左右；当处理温度为100 ℃时双乙酸钠、苯甲酸钠以及山梨酸钾对黑曲霉的抑菌率仅为30%左右。

图4 不同处理温度对防腐剂抑制黑曲霉性能的影响

综上，与3种传统防腐剂相比，肉桂酸钾对热胁迫具有较好的耐受性，其对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌性能几乎不受处理温度的影响，这可能是因为肉桂酸钾取自天然香料肉桂，肉桂具有高温卤煮特性，活性成分稳定，不易失活变性。

2.3 防腐剂对酱牛肉感官评价的影响

由表1可知，苯甲酸钠组和双乙酸钠组胀袋且产生异味，已经发生明显变质；此时山梨酸钾组未胀袋，有浓郁的肉香味，颜色正常，质构完整，但是肉质失去咀嚼特性，即将腐败变质；肉桂酸钾处理组一切正常，咀嚼特性良好，产品依然处于最佳品尝期。出现这样的现象或许与肉桂酸钾良好的热稳定性有关，在卤煮阶段加入防腐剂有利于防腐剂向食品内部均匀扩散，有助于延长产品保质期。然而，不耐高温型防腐剂的加入不能起到有效的防腐抑菌目的，因此在酱牛肉的防腐过程中肉桂酸钾较传统防腐剂具有显著性优势。

表1 室温储藏180 d后酱牛肉感官评价

2.4 防腐剂对酱牛肉中微生物的影响

高温酱卤结束后直接测定各实验组菌落总数为第0天微生物检测指标，各组原始菌落数相同，在保藏过程中每隔30 d进行微生物检测。由表2可知，肉桂酸钾防腐组在前150 d微生物检测中均未见菌落生长，在第180天肉桂酸钾防腐实验组菌落总数为（24±5）cfu·g-1，此时酱牛肉尚未变质。因此本实验将180 d作为肉桂酸钾应用于酱牛肉中的保质期。同理，双乙酸钠应用酱牛肉的保质期为60 d，苯甲酸钠对酱牛肉的保质期为90 d，山梨酸钾为150 d，而空白对照组（不添加任何防腐剂的酱牛肉）保质期＜30 d。实验结果表明肉桂酸钾可以延长酱牛肉的保质期，且添加肉桂酸钾的实验组保质期明显长于3种传统防腐剂，该结果与2.3中感官评价结论一致。此外，肉桂酸钾热稳定性好，在卤煮过程中添加防腐剂的方式不会破坏其生物活性，还有利于抑菌活性成分肉桂酸向食品内部扩散，从而延长肉制品保质期至180 d。

表2 不同防腐剂对酱牛肉中微生物的影响

2.5 防腐剂对酱牛肉中TVB-N的影响

不用防腐剂处理的酱牛肉在室温保藏180 d后，肉制品中挥发性盐基氮TVB-N含量变化如图5所示。挥发性盐基氮TVB-N可以指示食品中氨基酸是否发生腐败变质，TVB-N含量越低，食品腐败程度越低，意味着肉质越新鲜。在室温保存180 d后空白对照组酱牛肉样本中TVB-N含量最高，表明此时空白对照组已经发生变质，防腐处理组TVB-N含量相对较低，其中肉桂酸钾防腐处理组最低，表明肉桂酸钾在180 d室温保存中可以有效降低酱牛肉中氨基酸被破坏程度，使肉质保持新鲜可食状态。

图5 防腐剂对酱牛肉TVB-N的影响

3 结论与讨论

本研究通过探究肉桂酸钾与3种传统防腐剂受酸胁迫和热胁迫条件下的稳定性比较。发现苯甲酸钠、双乙酸钠、山梨酸钾以及肉桂酸钾等防腐剂均在酸性条件下对大肠杆菌和黑曲霉具有较好的抑菌性能，当pH值低至4.0时4种防腐剂对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌率均可达90%。当pH值升高时几种防腐剂的抑菌性均出现不同程度减弱，当pH值为6.0时仅肉桂酸钾可以保持50%左右抑菌率，较其他防腐剂对环境pH值的适应性更强。同时，肉桂酸钾具有较好的热稳定性，其对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌性几乎不随温度升高而变化，反观传统防腐剂双乙酸钠等在热处理过程中无法有效保持抑菌活性，极大地限制了这类防腐剂的使用范畴。将几种防腐剂应用到酱牛肉防腐保鲜中，实验结果表明具有良好热稳定性的天然香料防腐剂肉桂酸钾在卤煮过程中加入可以有效抑制酱牛肉中氨基酸腐败变质生成挥发性盐基氮，且可以保持酱牛肉较好的感官风味与口感，延长酱牛肉保质期。本研究为食品热加工工业防腐保鲜提供研究样本，为天然香料防腐剂的开发应用扩宽新的思路。