miR-143/145启动子区rs17723799多态性与宫颈癌易感性的相关性研究①

姜霁珂 龚建瑜 苏晓三 鲁刚旭 朱正凤 孙瑞芬 （云南中医药大学，昆明 650500）

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，全球范围内发病率和病死率位居女性恶性肿瘤第四，2018 年全球约有57 万病例，31.1 万例患者死亡，其中大部分发生于发展中国家［1］。我国宫颈癌发病率和病死率分别位居第六和第八，尽管近年发病率有所下降，但发病年龄逐渐呈年轻化［2-3］。HPV 感染是宫颈癌发病的主要原因，但吸烟、口服避孕药、多次妊娠也与宫颈癌发病有关［4］。大量研究表明，宫颈癌是一种多基因遗传病引起的疾病［5］。

miRNAs 是一类内源性长度为20～25 个核苷酸且具有多种调控功能的单链非编码RNA，通过与mRNA 3'-非编码区（3'-UTR）结合，在转录后水平调节基因表达［6］。研究表明，miRNAs 在细胞增殖、凋亡、分化、代谢和肿瘤发生等生理和病理过程中起重要调控作用［7-8］。单核苷酸多态性（SNPs）能够引起成熟miRNA 种子区基因突变，从而影响miRNA与靶点的相互作用，导致靶基因表达失调。研究表明，miRNAs 在癌症中呈差异性表达，并在其发生发展中起关键作用［9-10］。如赵成桂等［11］研究发现，miR-143/miR-145 启动子区rs4705342 CC 基因型增加了前列腺癌发病风险；miR-143-3p 异常表达能够影响食管癌细胞增殖和侵袭［12］。本研究对云南地区汉族人群进行了病例对照研究，探究miR-143/145 启动子区基因多态性对宫颈癌发病风险的影响。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 选取2015 年至2017 年延安医院就诊的242例宫颈癌患者及同期进行体检的249例健康志愿者作为研究对象。所有患者依据FIGO 确诊，并排除患有癌症、高血压、糖尿病家族史者，收集患者临床和病理特征，如年龄、临床分期、分化程度、淋巴结转移情况等（表1）。所有受试者均为无遗传关系的汉族女性，并签署知情同意书。

表1 研究对象基本情况［，例（%）］Tab.1 Characteristics of study population［，n（%）］

表1 研究对象基本情况［，例（%）］Tab.1 Characteristics of study population［，n（%）］

Items Age Clinical stages Control（n=249）49.9±8.9 Case（n=242）50.0±9.3 P 0.47 1 2 133（54.9）109（45.1）Differentiated status Well-moderate Poorly Lymph node metastasis Yes No-- -- --89（36.8）153（63.2）49（20.2）193（79.8）

1.1.2 主要试剂 DNA 提取试剂盒（北京Bioteke）；FFPE RNA 剂盒（美国 Omega Bio-Tek）；bulge loop miRNA QRT PCR primer（广东锐博）。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 室温下采集研究对象外周血2 ml至EDTA 抗凝管，采用提取试剂盒从血液样本中提取基因组DNA。SnaPshot 法分析rs17723799 多态性，并通过DNA 测序验证基因分型结果。引物序列：5'-ATGTACCAAGCCACAGGTCA-3'（正向）和5'-TACTGAAATCAGGGCCACGT-3'（反向）。

1.2.2 qRT-PCR 采用FFPE RNA 剂盒从石蜡包埋的宫颈癌组织中分离总RNA，采用bulge loop miRNA QRT PCR primer 反转录为cDNA，按照试剂盒说明对基因特异性引物进行qRT-PCR 反应。2-ΔΔCt法测定miR-143和 miR-145表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS23.0软件进行统计学分析。组间差异比较采用t检验。采用SNPstats软件（https：//www.snpstats.net/start.htm）检验rs17723799的基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡（HWE），并分析rs17723799 多态性与宫颈癌风险的关系。经年龄校正后，采用比值比（OR）和95%置信区间（95%CI）表示宫颈癌相对危险程度。采用单因素方差分析检验miR-143/145相对表达。计量资料以表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 rs1723799 多态性与宫颈癌风险的相关性rs1723799 多态性与宫颈癌风险的相关性见表2。基因型分布符合HWE（P＞0.05），经年龄校正后，宫颈癌患者rs1723799 TC 和TT 基因型频率低于对照组，差异有统计学意义（TC vs CC：校正OR=0.42，95%CI：0.28～0.63，P＜0.05；TT vs CC：校正OR=0.35，95%CI：0.19～0.63，P＜0.05）。显性模型中TC/TT 基因型的频率低于对照组，差异具有统计学意义（CC vs TC/TT：校正OR=0.40，95%CI：0.27～0.60，P＜0.05），隐性模型中TT 基因型频率低于对照组，差异无统计学意义（TT vs CC/TC：校正OR=0.61，95%CI：0.36～1.03，P=0.063）。

表2 rs1723799多态性与宫颈癌风险的相关性［例（%）］Tab.2 Association between rs1723799 polymorphism and risk of cervical cancer［n（%）］

2.2 rs1723799多态性与宫颈癌风险相关性的分层分析 根据宫颈癌组患者的临床特征，包括肿瘤分期、分化程度和淋巴结是否转移进行亚组分析，结果发现，rs1723799T/C 位点TC/TT 基因型在宫颈癌中淋巴结转移频率为44.9%，低于无淋巴结转移中的频率62.2%，差异有统计学意义（TC/TT vs CC：OR=2.03，95%CI：1.08～3.84，P=0.028）。TT 基因型在宫颈癌分期2期分布率为7.3%，低于1期的13.5%，差异有统计学意义（TT vs CC：OR=0.39，95%CI：0.16～0.99，P=0.026）。TC/TT基因型在宫颈癌分期2 期分布率为51.4%，低于1 期的64.7%，差异有统计学意义（TC/TT vs CC：OR=0.58，95%CI：0.34～0.97，P=0.037，表3）。

表3 rs1723799多态性与宫颈癌临床特征的关系［例（%）］Tab.3 Association of rs1723799 polymorphism with clinical features of cervical cancer［n（%）］

2.3 rs1723799 与宫颈癌组织miR-143/145 表达的关系 根据miR-143/145 启动子区rs1723799 在宫颈癌组织中的基因型分布，结合miR-143/145 在宫颈癌石蜡样本中的表达水平进行统计学分析，结果显示，rs1723799 位点 CC 基因型 miR-143 表达明显低于 TC 基因型（P=0.011），rs1723799 位点 TT 基因型miR-145表达明显低于TC基因型（P=0.014，图1）。

图1 rs1723799与宫颈癌组织miR-143/145表达的相关性Fig.1 Relationship between rs1723799 and expression of miR-143/145 in cervical cancer tissues

3 讨论

越来越多研究发现miRNAs 与宫颈癌发生发展密切相关［13-14］。miR-143/145位于人类第5号染色体长臂3区2带，研究发现宫颈癌患者血浆miR-145水平下降，提示miR-145 是宫颈癌诊断和预测放射敏感性的新的潜在生物标志物［15］。长链非编码RNA ACTA2-AS1在宫颈癌组织中呈高表达，而miR-143-3p表达则显著降低，ACTA2-AS 通过竞争性结合miR-143-3p上调SMAD3，从而加速宫颈癌进程［16］。HIF-1α是miR-143的靶基因，miR-143通过靶向HIF-1α调节宫颈癌细胞增殖和凋亡［17］。miR-143-3p通过靶向抑制TREM1 表达抑制肾小球系膜细胞炎症因子分泌及细胞增殖活性，从而发挥保护作用［18］。WEI 等［19］研究发现，miR-143/145 启动子中 rs4705342 T＞C 与缺血性脑卒中风险降低有关。有研究采用PCRRFLP 法分析 miR-34b/c 基因启动子区 rs4938723 多态性，发现结直肠癌组C等位基因频率高于对照组，TC 和 CC 基因型患者预后较差［20］。miR-143/145 启动子区rs353293 多态性与膀胱癌风险降低相关，低级别肿瘤患者AA/AG 基因型和A 等位基因发生率较低［21］。上述研究表明 miRNAs 启动子区 SNPs 与多种疾病有关，但确切机制尚未阐明，目前尚无miR-143/145 启动子区rs1723799 与宫颈癌发生、发展关系的报道。本研究通过比较宫颈癌组和对照组候选位点基因型频率分布，发现与rs1723799CC基因型相比，rs1723799 TC 和TT 基因型与宫颈癌风险降低有关，提示miR-143/145 rs1723799 多态性与云南地区汉族人群宫颈癌遗传易感性关系密切。

XU 等［22］发现低表达 miR-424 与宫颈癌分化程度、临床分期、淋巴结转移、血管受累情况等其他预后不良的临床病理参数呈正相关。miR-195 在宫颈癌组织及细胞系中均呈低表达，且与临床分期、淋巴结转移和深层基质浸润显著相关，认为miR-195通过靶向Smad3抑制宫颈癌细胞转移和侵袭［23］。研究发现，let-7家族启动子中rs13293512 CC基因型显著增加乳腺癌的风险，分层分析显示，rs13293512 CC基因型与雌激素受体阴性患者、孕激素受体阴性患者、T1～2 期癌症患者和 N1～3 期癌症患者乳腺癌风险增加相关［24］。本研究分层分析显示，rs1723799位点频率分布与宫颈癌临床特征相关，rs1723799 TC/TT 基因型的宫颈癌淋巴结转移频率低于无淋巴结转移者，证实miR-143/145 在宫颈癌发生发展中发挥重要作用。此外，根据miR-143/145 启动子区rs1723799多态位点在宫颈癌组织中的分布，结合该位点在宫颈癌组织中表达变化发现，携带rs1723799 TC基因型的患者与携带rs1723799 CC/TC基因型的患者相比，miR-143/145 表达更高，提示miR-143/145 启动子区SNPs 可影响该基因表达，一定程度影响宫颈癌易感性。

综上所述，miR-143/145 启动子区 rs1723799 多态性与云南地区汉族人群宫颈癌遗传易感性关系密切，携带rs1723799 TC/TT 基因型的宫颈癌患者淋巴结转移风险降低，携带rs1723799 TC 基因型的患者miR-143/145 表达水平更高。位于启动子区的单核苷酸多态性可能对基因表达产生影响，从而影响宫颈癌发生，因此对此类SNPs位点研究具有重大意义。本研究发现rs1723799 TC基因型可能是宫颈癌发展的生物标志物，为宫颈癌诊断和个体治疗提供了参考。

本实验仍存在一些不足，如样本选取为云南地区汉族人群，其结果不能代表其他民族，且由于缺乏生存信息，无法评估基因型对宫颈癌整体预后的影响。课题组后续将继续研究其他少数民族基因多态性与宫颈癌发生发展的关系，并进一步扩大研究样本量。