精神分裂症易感基因DISC1重组质粒pmirGLO-DISC1 3′UTR的构建和分析

宋红涛，焦东亮，王立金，沐林林，王文娟，宋佩佩，翟长平，何 震

精神分裂症断裂基因1(DSC1)是目前较明确的精神分裂症易感基因之一，其首次在一个具有染色体平衡易位的苏格兰精神疾病高发家系中被发现，后续研究[1]显示，DISC1与精神分裂症存在明显相关关系。精神分裂症的遗传模式复杂，难以用单纯的遗传因素来解释，目前认为可能是遗传因素和环境因素两者相互作用共同导致了精神分裂症的发生，表观遗传学解释了在不改变基因型的情况下环境因素是如何致病的。微小RNA(miRNA)作为表观遗传学的一员，可以靶向结合目标mRNA负性调控众多基因。精神分裂症关联的miRNA中，miRNA-181b表达和调控的异常与精神分裂症的发生和发展的密切关联已有报道[2-4]。miRNA-181b可能通过抑制DISC1基因及其蛋白的表达，影响突触和神经元的发育，在精神分裂症的发病过程中起重要作用。本研究拟通过生物信息学分析精神分裂症病人差异表达miRNA-181b-5p与精神分裂症易感基因DISC1的结合位点，选取包含结合位点在内的上下游200 bp长度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成目的基因，将合成的目的基因导入H343 pmirGLO空载体构建pmirGLO-DISC1 3′UTR，对构建的重组质粒进行分析和鉴定，以期为miRNA-181b-5p调控精神分裂症易感基因DISC1的机制研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料 超微量分光光度计(北京凯奥科技发展有限公司，K5600型)，PCR仪(Applied Biosystems，2720 thermal cycler)，凝胶成像分析仪(培清科技，JS-680D型)，DNA电泳槽(上海天能科技有限公司，HE-120型)。

H343 pmirGLO质粒和DH5α感受态细胞及和元无缝克隆试剂盒来自和元生物技术(上海)股份有限公司，AxyPrep质粒DNA小量抽提试剂盒来自爱思进生物技术(杭州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成 通过生物信息学分析精神分裂症病人差异表达miRNA-181b-5p与精神分裂症易感基因DISC1的结合位点，TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测到2个结合位点(见图1)，选取包含结合位点在内的上下游200 bp长度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成目的基因。

1.2.2 制备线性化表达载体 在限制性内切酶的作用下酶切表达载体，酶切反应体系如下：2 μg质粒，10×反应Buffer 5 μL和1 μL限制性内切酶，用纯水稀释至50 μL，然后在37 ℃水浴锅中孵育2 h以上。利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物的酶切效果，并从琼脂糖凝胶电泳后的胶中切割出目的载体条带，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0对切割的条带进行回收。

1.2.3 目的基因构建入线性化表达载体 将目的基因片段和线性化载体按照2∶1比例添加到离心管中，在无缝克隆试剂盒作用下进行重组反应30 min，将反应后的产物转移到冰上冷却5 min。反应产物可以直接用于转化，也可冷藏于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 转化和PCR鉴定 (1)取具有抗生素抗性的质粒2 μL放入100 μL DH5α感受态细胞中，将上述混合液放在冰上冷却30 min；(2)将混合液在42 ℃环境下热激90 s后,立即放置在冰上，冷却2 min；(3)加入1 mL LB液体培养基至管中，37 ℃、200 r/min 30min，活化细菌；(4)取50 mL菌液涂平板(如果转化效率低，可多取菌液或离心弃上清取下层涂板；涂菌棒在酒精灯上烘烤之后应搁置稍凉后再涂板，以防杀死细胞)，涂板时，感受态涂两个，有抗性，无抗性，转化后菌液涂一个有抗性(涂板后的平板先正放一会，干燥菌液后将其倒置在37 ℃培养箱中培养)；(5)选取平板上培养出的转化子，将其重悬于10 μL LB培养液中，从中选取1 μL模板进行菌落PCR鉴定。

1.2.5 阳性克隆鉴定和质粒小提 菌落鉴定得到的阳性克隆，送样本到和元生物技术(上海)股份有限公司进行测序验证，比对测序结果并分析，测序通过的阳性克隆，采用AxyPrep质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒。

2 结果

2.1 pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒图谱 以“Luc2-C-F GTG GTG TTG TGT TCG TGG AC”为正向测序引物，“SV40pA-F GCA ATA GCA TCA CAA ATT TC”为反向测序引物，Nhe Ⅰ和Sal Ⅰ分别为上下游克隆酶切位点，H343 pmirGLO为空载体，将合成的目的基因DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)置于空载体中，构建pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒(见图2)。

2.2 测序结果在NCBI/BLAST数据库中的比较和分析 将pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒的克隆序列与NCBI/BLAST数据库中的DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列分别推导出来的开放阅读框进行比对(dnaman1：送测序的pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒克隆序列的开放阅读框；dnaman2：NCBI数据库中DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列的开放阅读框)，结果表明：检测序列与目标序列的覆盖度为84%，相似度为100%。

2.3 pmirGLO-DISC13′UTR质粒的鉴定 将构建的pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒进行测序，结果与预期一致，部分测序法结果见图3。

3 讨论

DISC1基因与精神分裂症的关联最初是在苏格兰家系报道，此后在德国[5]、芬兰[6]、中国[2-3]等地区人群的相关研究也证实了DISC1基因与精神分裂症的发病存在一定的关联。国外有研究[6]发现，精神分裂症病人的快感缺乏症状与DISC1基因有关联。进一步研究[7-9]发现，无论是在发育早期还是青春期后的大脑中，DISC1对突触的形成和神经元发育均有重要调控作用，DISC1基因和DISC1蛋白在早期神经发育和成年后海马神经发过程中扮演着重要的角色，与精神分裂症的发生和发展有关。精神分裂症的遗传模式复杂，单卵双生子拥有一致的基因型，但精神分裂症的同病率只有50%左右[10]，目前认为基因和环境的相互作用影响了精神分裂症的病理生理过程。表观遗传学作为一种非传统的遗传模式，解释了基因型不变的情况下环境因素是如何致病的。

miRNA凭借其在转录后水平对基因表达的调控，可以靶向调控大脑的分化和发育过程中的多个基因，对神经突的形成、保持和生长等过程也有重要的调控作用[4]。有研究[11]发现，精神分裂症病人体内miRNA的差异表达与精神分裂症的发生和发展有关联。精神分裂症关联的miRNA中，miRNA-181b表达和调控的异常与精神分裂症的发生和发展的密切关联已有报道[2-4]。2008年BEVERIDGE等[12]选取21组病例和对照，利用基因芯片和实时定量PCR发现，miRNA-181b在精神分裂症病人颞上回和背外侧前额叶区中表达上调，进一步分析发现miRNA-181b可以靶向调控精神分裂症的易感基因VSNL1[13]和AMPA[14]。2017年LIU等[15]检索1990-2016年发表的有关精神分裂症miRNA的文章，筛选出6篇合计330例精神分裂症病人和202名健康对照者进行分析，也进一步证实了miRNA-181b在精神分裂症病人外周血中高表达，对精神分裂症具有较高的诊敏感度和特异度。由此可见，miRNA-181b的差异表达可能在精神分裂症的病理生理过程中起重要作用，但关于miRNA-181b在精神分裂症发病中的机制暂无具体报道。

本研究运用TargetScan预测和分析hsa-miRNA-181b-5p(miRNA-181b的成熟体)的靶基因发现，hsa-miRNA-181b-5p可以靶向作用于DISC1，DISC1的3′UTR区有2个hsa-miRNA-181b-5p的结合位点，选取包含结合位点在内的上下游200 bp长度序列DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)人工合成了目的基因。以H343 pmirGLO为空载体，将合成的目的基因DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)置于空载体中，成功构建了pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒。将pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒的克隆序列与NCBI/BLAST数据库中的DISC1 3′UTR(1.26 kb-WT)序列进行比对分析发现，检测序列与目标序列的覆盖度为84%，相似度为100%，进一步对构建的pmirGLO-DISC1 3′UTR质粒进行测序，结果与预期一致。由此可见，本研究成功构建了精神分裂症易感基因DISC1重组质粒pmirGLO-DISC1 3′UTR，为miRNA-181b-5p调控精神分裂症易感基因DISC1奠定了基础，可以用于后续研究。