我国部分地区猪产气荚膜梭菌流行病学调查及毒素型分析

张汉云，冯 琪，蓝国文，张 杭，于高博，尚志祥，林瑞庆

（1.广州市番禺区动物防疫监督所，广东 广州 511400；2.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringen, Cp），又名魏氏梭菌，温和厌氧，是革兰氏阳性产芽孢粗大杆菌，经常单个存在，有时可见偶链状排列[1-3]。Cp可引起人类食物中毒、多种动物坏死性肠炎及肠毒血症，是一种人畜共患病原菌[4]。Cp在自然界中广泛分布，常见于土壤、污水、饲料、人和动物的肠道及粪便中，是人和多种动物胃肠道的常在菌群之一，在外界以芽孢存在，抵抗力强[5-7]。Cp主要通过产生毒素导致机体发病，也可以通过在形成芽孢过程中合成孢内肠毒素而致病[5-9]。Cp严重影响畜禽的健康，给畜牧养殖业造成了严重的经济损失，同时对人和动物的健康造成了极大的威胁[5]。

产气荚膜梭菌能产生多种外毒素和侵袭性酶类，根据其产生的4种主要毒素（α、β、ε和ι）[8-10]，Cp可分为A、B、C、D、E 5种类型，除此之外，最新的分类还依据肠毒素（CPE）和坏死性肠炎毒素B（NetB）增加了F和G型[11]，其中A型和C型Cp是导致畜禽发病的主要病原。

目前，在猪群各阶段中广泛流行的产气荚膜梭菌病例中，一般认为C型菌株是导致2周龄内仔猪肠毒血症和坏死性肠炎的主要病原，而A型菌株则与哺乳及肥育猪肠道疾病有关[12]。因此，猪产气荚膜梭菌病主要是由A型或C型产气荚膜梭菌引起各年龄阶段猪发生的一种急性、致死性肠道传染病。产气荚膜梭菌除了引起仔猪发生高度致死性、坏死性肠炎外，近年来，由产气荚膜梭菌引起肥育猪、后备种猪、怀孕母猪等猝死常有报道[2，13-14]。本研究对我国部分地区猪的产气荚膜梭菌感染情况及菌株毒素分型进行调查和分析。

1 材料与方法

1.1 样品收集

2021年3—10月试验收集了湖南、浙江、福建、广东等4省8市的规模化养猪场各阶段猪的新鲜粪便样品74份和肠道样品15份，以及采集了广州某生猪屠宰场肝脏和肺脏样各30份，置于密封袋里，4 ℃保存。

1.2 样品处理

粪便和肠道样品：取适量小肠和结肠段内容物或适量粪便放置到含有20 mL PBS溶液的50 mL的离心管中，涡旋震荡5 min，于室温下静置20 min。

肝脏和肺脏样品：手术刀在酒精灯外焰上方灼烧后无菌烙烫肝脏和肺脏组织表面，在烙烫过的组织表面横切一小口，用一次性接种环无菌蘸取组织样，后把接种环置于含有20 mL PBS溶液的50 mL的离心管内，涡旋震荡5 min，于室温下静置20 min。

1.3 产气荚膜梭菌的分离鉴定

在超净工作台中，取50 mL离心管中样品稀释液上清100 μL加入到含有5 mL FT培养基的10 mL灭菌试管中，40 ℃恒温培养箱中培养过夜。参考生活饮用水标准检测方法中的微生物指标的稀释方法，梯度稀释培养过夜的菌液，浓度依次为10-1、10-2、10-3、10-4。分别取10-2、10-3、10-4各100 μL到3个含有环丝氨酸的TSC卵黄平板中，40 ℃恒温培养箱厌氧培养12～16 h。挑取目的菌落接种进行增菌，提取DNA模板，经16S rDNA PCR后1%琼脂糖凝胶电泳，后测序鉴定阳性菌株。

1.4 引物合成及反应条件

参考李昆等[15]文献，使用由华大基因公司合成的细菌16S rDNA（27 F/1 492 r）通用引物（表1）。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，52.0 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。参考赵凤菊等[16-17]文献的引物进行毒素型分析，PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物均用1%琼脂凝胶电泳110 V，30 min检测。

表1 7种毒素的特异性引物和细菌16S rDNA通用引物

2 结果与分析

TSC卵黄平板中周围生长有乳白色浑浊的黑色菌落可能为产气荚膜梭菌菌落（图1左），对菌落进行革兰氏染色镜检，为两端稍钝圆粗大杆状革兰氏阳性细菌（图1右），再进一步进行分子鉴定。

图1 产气荚膜梭菌菌落及革兰氏染色

2.1 PCR检测结果

149份样品经细菌分离培养纯化后进行16S rDNA PCR鉴定，31份（20.81%）呈阳性，其中10份（13.51%）来源于粪便，5份（33.33%）来源于肠道，16份（26.67%）来源于肝肺组织样品。

产气荚膜梭菌16S rDNA PCR扩增片段大小约为1 500 bp，部分样品检测结果如图2所示。阳性产物送检华大基因测序确认为产气荚膜梭菌。

图2 产气荚膜梭菌的PCR扩增电泳

2.2 产气荚膜梭菌毒素型分析

对分离鉴定后得到的31株产气荚膜梭菌进行毒素型鉴定（图3），结果全部为A型产气荚膜梭菌（100%），且携带Cpb2毒素23株（74.19%）；未见其他型菌株。

图3 代表性分离株的PCR产物扩增电泳

2.3 猪产气荚膜梭菌的检测结果统计

广州某生猪屠宰场肝脏和肺脏样本各30份，检出阳性分别为9份和7份，总阳性率为26.67%。不同地区、不同阶段猪粪便和肠道样品产气荚膜梭菌的检测结果见表2—表4。

表2 不同地区粪便产气荚膜梭菌的检测结果

表3 不同地区肠内容物产气荚膜梭菌的检测结果

表4 不同阶段猪产气荚膜梭菌检测结果

结果显示，各个地区受检样品中产气荚膜梭菌阳性率不等，粪便阳性率检测最高的地区为广东肇庆和福建龙岩，肠道检测率最高的地区为湖南永州和浙江金华，其次为福建龙岩。

3 讨论

产气荚膜梭菌可引起多种人兽共患传染病，慢性表现为临床症状不明显，但急性易引起多种动物的突然猝死[18]，已成为危害人类及影响养殖业健康发展的重要病原之一。产气荚膜梭菌所分泌的外毒素和各种酶是其主要致病因素，多作用于胃肠道，造成感染动物的急性死亡，其中A型产气荚膜梭菌易引起人和动物的气性坏疽和食物中毒。

产气荚膜梭菌是动物肠道潜在的条件性致病菌群之一，当机体处于健康情况时该菌不会引起疾病，但当动物处于亚健康状态或各种原因引起肠道炎症时，胃肠道的菌群平衡被打破，菌群失调，产气荚膜梭菌会快速增殖并产生大量毒素，对机体造成损伤[19]。

饲料全面禁抗后养殖业尤其是在生产管理、环境控制以及防疫保健跟不上或不到位的猪场，极易导致产气荚膜梭菌等条件性致病菌的增多，坏死性肠炎等细菌性疾病发病率增加，甚至导致猪只死亡，并易继发其他疾病造成养殖风险加大[20]。养殖户除注意饲养管理外，更要采取相应的预防控制措施[21]。

本试验对不同地区猪场不同阶段的猪群粪便样品、肠道内容物进行了检测，结果显示，不同地区猪场的不同阶段猪群产气荚膜梭菌检测阳性率有所不同，可能跟环境及猪群健康管理水平及样本数有关。毒素分型结果表明，普遍为A型且广泛携带Cpb2毒素。根据王苗利等[22]提到的感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位研究，细菌在动物体内大量繁殖后产生毒素，因α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶的活性，能破坏细胞膜结构的完整性，并随血液循环系统到达宿主的特定脏器和全身，从而引起组织脏器的损伤。有研究证明，Cpb2毒素对某些细胞具有体外细胞毒性[23]。近年来很多文献也表明Cpb2毒素与猪梭菌性肠炎有很大关系[24-26]。鉴于本试验中屠宰场采集的肝肺样品产气荚膜梭菌的阳性检出率比较高，可能因产气荚膜梭菌增殖引致肠道菌群微生态平衡被打破，病原及毒素迁移到感染动物的肝、肺中，导致了全身性症状，既不利于动物的健康，同时也带来食品安全问题，需引起关注。