肝纤维化指标与病毒载量、病理炎症分级及纤维化分期的关系

申可，吴国标，吴彩虹，陈坚平，刘自光

南方医科大学顺德医院（佛山市顺德区第一人民医院）病理科，广东佛山 528300

随着社会经济的快速发展，人们的生活方式与饮食结构发生巨大变化，这使得各种肝脏疾病的发病率也越来越高，相关的肝脏疾病病理研究也在不断深入[1]。现阶段的研究显示，在肝纤维化的诊断上，发现透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）、板层素（LN）以及Ⅲ型前胶原（PCⅢ）等纤维化指标与肝纤维化存在一定的相关性[2]。为探讨各种肝纤维化指标同疾病炎症程度、病毒含量以及病理纤维化之间的相关性，本次研究纳入2015年1月—2021年7月南方医科大学顺德医院收治的164例肝纤维化患者为研究对象，采集血液并离心分离血清，实施乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）DNA的定量测定，同时还对一部分的病例实施肝细胞活检检查，测定相关的肝纤维化指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取本院收治的164例肝纤维化患者进行回顾性分析，其中男112例，女52例；年龄7～83岁，平均（51.12±2.45）岁；慢性肝炎轻度66例，慢性肝炎中度53例，慢性肝炎重度31例，肝硬化14例。遵循自愿原则，根据患者意愿并结合临床指标排除存在肝组织穿刺活检禁忌证患者，有84例患者进行肝组织穿刺活检。针对HBV-DNA含量进行分组，细分为≤1 000、1 000～3 999、4 000～9 999、≥10 000；并根据炎症活动度及纤维化程度将患者分成1～4级（G）和1～4期（S）。见表1。

表1 慢性肝炎分级、分期标准

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合《肝病诊疗指南》[3]的相关诊断标准者；HBV感染者；病例资料齐全，具备正常沟通、交流能力患者；自愿参加研究并且签署知情同意书的患者。排除标准：合并心、肾等器质性疾病者；合并恶性肿瘤疾病者；合并血液系统疾病及免疫疾病者；合并精神疾病及认知功能障碍者。

1.3 方法

按照无菌及标准原则，采集所有患者的静脉血液标本，将采集的血液加入到肝素抗凝管中，以3 000 r/min的速度持续离心15 min分离血清。针对HBV-DNA的检测，具体应用荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）法测定，具体操作如下：应用PCR荧光探针法检测血清HBV DNA载量，仪器购自湖南圣湘生物科技有限公司，仪器型号为ABI7500。在各PCR反应管均加入5 μL的核酸释放剂，同时加入5 μL待检测的血清样本，吸打3～5次后充分混匀，间隔时间＞10 min，在2 000 r/min的离心机中持续离心30 s，之后将反应管置于扩增仪中，设定的循环参数如下：50℃2 min，94℃ 5 min，94℃ 15 s，57℃退火、延伸及荧光采集循环45次，之后在25℃下冷却10 s，借助扩增曲线获得定量检测结果。

肝组织活检则是应用双人操作经皮肝穿刺法获取肝组织，经HE染色以及网状纤维染色判定结果。采取化学发光法测定血清HA、Ⅳ-C、LN以及PCⅢ指标水平，检测所用的试剂均购自郑州安图生物工程股份有限公司。结果均由资深病理医师根据双盲随机原则按GS分级分期标准进行判读，统一进行阅片，在光学显微镜下对病理情况进行观察。

1.4 观察指标

比较不同HBV-DNA含量、不同病理炎症分级、不同病理纤维化分期患者的血清肝纤维化指标[透明质酸（hyaluronic acid, HA）、Ⅳ型胶原（IV collagen, Ⅳ-C）、板层素（laminin, LN）以及Ⅲ型前胶原（procollagen Ⅲ, PCⅢ）]水平，并分析肝纤维化HBV-DNA含量、病理炎症分级、肝纤维化分期与血清肝纤维化指标的相关性。

1.5 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以（）表示；相关性分析采用Pearson分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纤维化指标水平比较

不同HBV-DNA含量患者血清肝纤维化指标水平对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

表2 不同HBV-DNA含量患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

病毒含量HBV-DNA（+）（n=164）≤1 000（n=47）1 000～3 999（n=52）4 000～9 999（n=30）≥10 000（n=35）HA 161.99±266.23 189.07±281.96 139.51±270.07 153.87±231.77 168.56±276.61Ⅳ-C 114.52±155.43 123.53±185.93 96.61±94.20 114.05±133.31 129.61±200.61 LN 80.63±79.94 65.25±60.10 73.70±69.73 103.03±108.98 90.07±84.09 PCⅢ15.16±10.23 16.73±10.93 14.30±8.58 13.03±8.79 16.26±12.40

2.2 不同病理炎症分级患者的血清肝纤维化指标水平比较

不同肝纤维化病理炎症分级患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 不同病理炎症分级患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

表3 不同病理炎症分级患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

注：与G1期比较，aP＜0.05；与G2期比较，bP＜0.05；与G3期比较，cP＜0.05；与G4期比较，dP＜0.05

分级G1（n=8）G2（n=32）G3（n=32）G4（n=12）PCⅢ16.97±13.97 13.69±8.68 12.91±5.64（18.53±9.05）c HA 62.16±30.88 52.66±18.72（87.10±54.74）b（321.55±223.09）abcⅣ-C 38.31±16.90 44.63±22.54（70.23±36.61）ab（258.15±152.25）abc LN 29.77±16.27 36.93±22.72（46.26±16.96）a（133.67±55.07）abc

2.3 不同病理纤维化分期患者的血清肝纤维化指标水平比较

不同病理纤维化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平对比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 不同病理纤维化分期患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

表4 不同病理纤维化分期患者的血清肝纤维化指标水平比较 [(),μg/L]

注：与S1期比较，dP＜0.05；与S2期比较，eP＜0.05；与S3期比较，fP＜0.05；与S4期比较，dP＜0.05

分期S1（n=15）S2（n=38）S3（n=16）S4（n=15）PCⅢ14.31±10.42 13.64±8.46 13.74±6.06 17.82±8.59 HA 58.38±27.56 61.00±31.47（96.45±66.18）de（289.23±220.80）defⅣ-C 49.29±29.22 50.77±29.83（69.70±34.17）d（233.49±154.13）def LN 36.89±26.06 42.17±20.04 39.88±14.66（120.03±62.10）def

2.4 肝纤维化HBV-DNA含量、病理炎症分级、肝纤维化分期与血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相关性分析

患者病理炎症分级、肝纤维化分期与血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ呈正相关关系（P＜0.05）；而HBVDNA含量与肝纤维化指标无显著相关性（P＞0.05）。见表5。

表5 肝纤维化HBV-DNA含量、病理炎症分级、肝纤维化分期与血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的Pearson相关性分析

3 讨论

HBV感染疾病的自然进程主要分成免疫耐受期、免疫清除期、非活动复制期以及再活动期，在受到HBV感染后，可引起机体免疫功能的降低，并且还会出现免疫调节功能紊乱等情况，这样使得疾病发生发展[4-6]。处在免疫耐受期时，HBV DNA复制活跃，并且在谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）水平上表现正常或者是轻度升高的态势，肝组织出现轻微的病理变化以及未见炎症样坏死情况[7]。处在免疫清除期时，则可见ALT水平显著升高，HBV DNA载量降低，肝组织可见炎症病变。因此对于不同的HBV DNA含量患者，在肝组织上表现出不同炎症改变情况。

现阶段，研究结果显示，慢性肝炎患者进展到肝硬化需要经历肝纤维化这一过程[8]。针对肝纤维化可通过相关肝纤维化指标HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ的测定辅助早期诊断[9]。慢性乙肝是HBV感染性疾病，对此类患者，血清HBV-DNA是一种可以辅助反映乙肝病毒感染最为直接以及可靠的指标，主要是HBV在患者体内复制活跃，会激活自身免疫应答，而免疫应答会间接引起肝细胞功能的损伤，对此进行此类指标的测定具有积极意义。

本研究结果显示肝纤维化患者血清HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ同HBV-DNA的含量无明显相关性（P＞0.05），这一结果提示，肝硬化的发生发展过程，侵入机体的乙肝病毒数量以及复制能力同病变无明显关联。而对84例患者进行肝组织病理活检，判定患者病理炎症分级及纤维化分期，应用到GS分级评价方式，GS分级是根据病理活检的组织切片进行诊断分级分期的，G是炎症程度分级，S为纤维化程度分期。本研究结果显示，根据不同肝纤维化病理炎症分级，不同病理纤维化分期患者的HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ水平对比，差异有统计学意义（P＜0.05），提示肝纤维化指标可以用于评价慢性乙肝炎症程度及病理纤维化情况。本次研究结果显示，肝 硬 化 者 HA 为（289.23±220.80）μg/L、IV-C 为（233.49±154.13）μg/L、LN 为（120.03±62.10）μg/L、PCⅢ为（17.82±8.59）μg/L，与其他分期肝纤维化指标水平对比，差异有统计学意义（P＜0.05）；张晶[10]的研究显示，肝硬化者HA为（148.45±61.21）ng/mL、PCⅢ为（141.26±47.02）μg/L，LM、HA、PCⅢ指标随着患者肝纤维化程度加重和炎症活动度加重而呈现升高趋势，这一结果与本研究结果类似。对于慢性乙肝患者，在临床诊断上，可以加强对相关生化指标的测定。在具体测定上，HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ可以反映出肝纤维化的情况，其中HA属于一种酸性黏多糖，1934年首次从牛眼玻璃体中分离出这一物质，该物质有独特分子结构以及理化特性，这样使得其具有多种生理功能，比如润滑关节及调节血管壁的通透性，使水电解质扩散及运转，促进创伤的愈合[11-12]。Ⅳ-C属于基底网状结构重要组成成分，在细胞内合成能直接以前胶原的形式参与细胞外间质组成，在肝脏纤维化的时候早期可见其增生，转换快，之后以持续沉积的层粘连蛋白构成完整基底膜。LN是构成细胞间质的非胶原糖，在肝内主要是由内皮细胞以及贮脂细胞合成，可同胶原一同构成基底膜成分，主要作用是同多种基底膜成分进行结合，调节细胞的生长以及细胞的分化[13-15]。PCⅢ主要是可反映出肝内Ⅲ型胶原的合成，PCⅢ水平的持续升高可表现出病情的持续性变化，而PCⅢ下降甚至正常可预示病情的缓解，如此也表明PCⅢ用于评估纤维化有重要意义，且能辅助医师判定疾病严重程度，指导对疾病的合理治疗，最大限度的保证患者生命健康[16]。本次研究也进行相关性分析，显示病毒载量同肝纤维化指标无显著相关性（P＞0.05），而疾病病理炎症分级及纤维化分期与肝纤维化指标呈正相关（P＜0.05），表明测定肝纤维化指标可评估疾病病理分期及分级情况，从而为疾病的治疗提供一定参考借鉴。

综上所述，针对慢性乙肝及肝硬化，在病变的发展期间，通过测定肝纤维化HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ相关指标，可以预测疾病病理炎症分级及纤维化分期情况，辅助对疾病的有效治疗。