AnnexinA2-siRNA对甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭和转移的作用及机制

陈尚 王超 王昊 张星霖 郑飞波 袁胜利 陈润芝 石德道

(1青岛市市立医院，山东 青岛 266000；2开封市中心医院；3湖北省肿瘤医院)

近年来甲状腺肿瘤发病率呈现逐年增加的趋势，其中最常见的是甲状腺乳头状癌(PTC)〔1〕。PTC具有恶性程度低预后生存率高的特点，但分化程度高早期淋巴结转移的特点为临床治疗带来了一定困难。大部分手术切除的PTC患者需终生服药，术后给予放射性I131治疗对身体副作用较大。近年来生物学靶向基因治疗成为该领域的研究热点。甲状腺癌的发生是由多种因素共同作用的结果。膜联蛋白(Annexin)是一类在单核细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞等多种细胞中发现的Ca2+依赖性膜磷脂结合蛋白家族，其中AnnexinA2是重要的家族成员之一〔2〕。AnnexinA2在肝癌、肺癌和胃癌等多种肿瘤存在异常高表达，在调节肿瘤细胞侵袭迁移、增殖和凋亡等生物学功能中发挥重要作用，与肿瘤的发生发展密切相关〔2～5〕。研究表明AnnexinA2在PTC中呈现高表达，与肿瘤的浸润、侵袭、转移有着密切的相关性〔6〕。AnnexinA2在PTC细胞中的作用机制尚不清楚。本研究通过siRNA转染沉默PCT K1细胞中AnnexinA2基因，观察基因沉默后细胞侵袭、迁移能力的变化，并进一步探讨其可能的作用机制，为PTC分子生物治疗的提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料 PTC、甲状腺良性肿瘤和正常组织标本各20例均来青岛市市立医院2016年10月至2018年3月PTC患者，每种组织类型男女各10例，年龄18～63岁。术后经病理证实为PTC和甲状腺良性肿瘤，标本置于-80℃保存。本实验研究标本的采集经医院伦理委员会批准。

1.2实验试剂与仪器 NC-siRNA和AnnexinA2-siRNA(上海吉玛基因有限公司)，兔抗人AnnexinA2单克隆抗体和β-catenin抗体(英国Abcam公司)，兔抗人c-myc、细胞周期蛋白(cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和GAPDH抗体(美国CST公司)，山羊抗兔(lgG)二抗和Western印迹检测试剂盒(上海碧云天有限公司)，噻唑蓝(MTT)试剂盒和基质胶(美国BD公司)，Transwell小室(美国Corning 公司)，SYBR Green qPCR Master Mix和逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)，Trizol RNA提取试剂、AnnexinA2、MMP-2、MMP-9引物和转染试剂lipofectamineTM2000(美国 Invitrogen公司)。qRT-PCR仪器(中国香港Gene Company Limited)，倒置高分辨率荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)，酶标仪(美国 Bio-Rad 公司)，AI600凝胶成像系统(美国GE Healthcare 公司)。

1.3实验方法

1.3.1细胞培养 PTCK1 细胞由天津医科大学基础医学院赠予，K1细胞采用含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640，置于37℃、5%CO2细胞孵箱中传代培养。

1.3.2细胞转染 采用lipofectamineTM2000瞬时转染法。取处于传代次数在5代以内且处于对数生长期的K1细胞，将细胞以5×105/孔数量均匀接种于6孔板中，置于细胞培养箱中培养，待细胞达到50%～70%融合度时进行转染。按照转染试剂lipofectamineTM2000说明书将人工合成的NC-siRNA和AnnexinA2-siRNA分别转入siRNA-NC组和siRNA-AnnexinA2组，空白对照组无任何处理。6～8 h后换液，10%FBS的RPMI1640常规培养，进一步采用实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western印迹评估细胞转染的干扰效果。各组设置3～5个复孔，平行实验3次。

1.3.3沉默AnnexinA2基因对细胞mRNA表达量的影响 采用qRT-PCR法。按Trizol法进行操作提取细胞总RNA，验证纯度后逆转录合成cDNA，然后进行PCR扩增。扩增条件为：95℃ 预变性15 s，95℃ 变性30 s，60℃ 30 s，72℃ 延伸40 s，40个循环。引物AnnexinA2序列：5′-AAATGTCTACTGTTCACGAAATCC-3′(正义链)和5′-TAGTCGGGCTTCAGTCAGT-3′(反义链)。引物β-catenin序列：5′-TCTGACCTGATGGAGTTGAG-3′(正义链)和5′-CTTACTTGCTCATGCGTGGA-3′(反义链)。引物c-myc序列：5′-TGTAGTAATTCCAGCGAGAG-3′(正义链)和5′-CGCAGATTGTAAGTTCCAG-3′(反义链)。引物cyclinD1序列：5′-CAGTAGTGCGAAGCATAGGAGA-3′(正义链)和引物5′-GATGCACGAGTAGTCGAGTAG-3′(反义链)。引物MMP-2序列：5′-AGAGCTGGCCTAGTGATGACT-3′(正义链)和5′-GCGCATGGTCTCGATGGTTC-3′(反义链)。引物MMP-9序列：5′-CATGGACATCGTCATCCACT-3′(正义链)和5′-ACATTGGCCTTGGAAGATCG-3′(反义链)。引物内参GAPDH序列：5′-GGGCGCCTGGTCACCAGGGCTG-3′(正义链)和5′-GGGGCCATCCACAGTCTTCTG-3′(反义链)。每组设置5个复孔，实验平行进行3次。

1.3.4沉默AnnexinA2基因对细胞蛋白表达水平的影响 采用Western印迹。待细胞密度达到85%～95%时，收集各组细胞采用蛋白提取试剂盒提取细胞总的蛋白，蛋白定量后变性(100℃，5 min)，置于-80℃保存待用。蛋白量40 μg/泳道上样，凝胶电泳成功后，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，新鲜脱脂奶粉封闭1 h，分别加入配制的一抗稀释液。室温12 h，洗膜后分别加入二抗，置于室温2 h，加入显色剂，采用化学发光成像仪曝光显色。以GAPDH为内参，计算各组蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.3.5沉默AnnexinA2对细胞增殖能力的影响 采用MTT比色法。转染成功后，取100 μl细胞悬液(3×104/100 μl)均匀接种于96孔板中，孔板四周边缘加入100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，常规培养24、48、72、96 h，换液后加入10 μl MTT稀释液，吹打均匀后置于37℃恒温箱反应4 h，清除培养基，各孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)。震荡反应15 min后，在酶标仪490 nm波长下测吸光度(OD)，OD值代表细胞的增殖活性。各组设6个复孔，重复实验3次，计算结果取平均值。

1.3.6沉默AnnexinA2对细胞侵袭能力的影响 采用Transwell小室法。首先制备Transwell侵袭小室，按照基质胶按照说明书用培养基进行比例(1∶3)稀释，每孔取基质胶稀释液均匀涂抹于上室，于细胞超净台紫外线灯下照射4 h备用。转染成功后，采用不含有FBS的培养基将同等条件下转染成功的细胞制备成单细胞悬液，取200 μl的细胞悬液(2×103/200 μl)均匀接种于小室的上室，下室中加入600 μl的10%～15%FBS RPMI1640，置于37℃、5%CO2细胞培养箱。48 h后，清除上室，将小室4%多聚甲醛固定30 min，HE染色。实验重复3次。于倒置显微镜下观察穿透的细胞数，随机选取5个视野/组，取平均值。

1.3.7沉默AnnexinA2对细胞迁移能力的影响 采用Transwell小室法。其余步骤依次按照细胞的侵袭试验进行。于倒置显微镜(200倍)下观察穿膜的细胞数，随机选取5个视野/组，取平均值。平行实验重复3次。

1.4统计方法 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1AnnexinA2在PTC组织中的表达 与甲状腺良性肿瘤组织(0.218)和正常组织(0.193)相比，PTC组织中AnnexinA2 mRNA(0.982)的相对表达量较高(P<0.05)，而甲状腺正常组织和甲状腺良性肿瘤组织之间无显著性差异(P>0.05)。

2.2siRNA转染细胞的干扰效果

2.2.1细胞中AnnexinA2 mRNA的表达量 转染K1细胞后，AnnexinA2 mRNA的相对表达量分别是：空白对照组(1.000±0.000)、siRNA-NC组(0.934±0.042)、siRNA-AnnexinA2组(0.356±0.056)，siRNA-AnnexinA2组中AnnexinA2 mRNA表达量显著降低(P<0.05)；siRNA-NC组和siRNA-AnnexinA2组无显著性差异(P>0.05)；表明小干扰RNA瞬时转染有效地降低K1细胞中AnnexinA2 mRNA的表达水平。

2.2.2细胞AnnexinA2蛋白的表达量 细胞转染后，AnnexinA2蛋白的相对表达量分别为：空白对照组(0.976±0.073)、siRNA-NC组(0.953±0.059)、siRNA-AnnexinA2组(0.253±0.034)，与空白对照组和siRNA-NC组相比，siRNA-AnnexinA2组中AnnexinA2蛋白的相对表达水平明显降低(P<0.05)，空白对照组和siRNA-NC组无显著差异(P>0.05)；表明AnnexinA2-siRNA转染可以显著抑制K1细胞的AnnexinA2蛋白的表达。见图1。

图1 Western印迹检测细胞中AnnexinA2蛋白的相对表达

2.3细胞增殖活性的变化 细胞转染成功后，MTT法检测不同时间段(24、48、72、96 h)细胞的增殖活性，与空白对照组和siRAN-NC组相比，siRNA-AnnexinA2组细胞OD值降低(P<0.05)，表明AnnexinA2-siRNA可以抑制K1细胞的增殖活性。见表1。

表1 各组各时间段细胞OD值比较

2.4细胞迁移和侵袭能力的变化 体外细胞迁移结果示：与空白对照组、siRNA-NC组比较，siRNA-AnnexinA2组穿透的细胞数明显减少(P<0.05)，空白对照组和siRNA-NC组无显著性差异(P>0.05)。体外细胞侵袭结果示：与空白对照组和siRNA-NC组相比，siRNA-AnnexinA2组细胞穿透基质胶的数明显减低(P<0.05)，空白对照组和siRNA-NC组无显著性差异(P>0.05)。见图2、图3、表2。

图3 Transwell小室法检测细胞侵袭(HE，×200)

表2 各组细胞穿膜数比较个，n=6)

2.5细胞中c-myc、cyclinD1、β-catenin、MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达 与空白对照组和siRNA-NC组相比，siRNA-AnnexinA2组细胞中c-myc、cyclinD1、β-catenin、MMP-2和MMP-9蛋白和mRNA的相对表达均明显降低(均P<0.05)；而空白对照组和siRNA-NC组无显著性差异(均P<0.05)。表明细胞转染成功后可以有效地抑制Wnt/β-catenin 信号通路蛋白及其下游侵袭相关蛋白的表达。见图4、表3。

图4 蛋白免疫印迹法检测细胞中β-catenin、c-myc、cyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的相对表达

3 讨 论

小干扰siRNA是一种基因阻断的技术，它通过特异性地敲除或部分敲除目的基因的表达水平，在靶基因干扰的探索研究中得到广泛认可〔7〕。体外合成siRNA主要通过RNA链的5′端磷酸化而发挥活性，它的每一个位点在识别基因靶序列的过程中往往具有高度的特异性，从而达到目的基因有效地沉默〔8，9〕。目前通过小干扰RNA进行靶基因干扰的肿瘤生物学治疗已经成为研究的热点。

AnnexinA2是膜联蛋白家族中分子量为36 kD的蛋白质〔10〕。在AnnexinA2一般包括3个不同的功能区：N末端区域，C末端区域和核心区；其中N末端区域中主要包括组织纤溶酶原活化剂(tPA)和钙结合蛋白S100/A10(P11)〔11〕。AnnexinA2与细胞表面的纤溶酶原和组织纤溶酶原激活物结合，导致纤溶酶原转化为纤溶酶。在金属蛋白酶的激活中，纤溶酶作为丝氨酸蛋白酶在细胞外基质成分的降解中发挥着关键作用〔12〕。甲状腺癌在女性肿瘤中排名第五位〔13〕，主要分为乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌四种病理类型，其中乳头状癌最为常见，虽预后良好但早期易发生多发淋巴结浸润甚至远处转移。近年来有关PTC基因靶向治疗成为研究的热点。研究表明〔14～16〕AnnexinA2在结直肠癌、前列腺癌和肝癌等多种肿瘤存在异常表达，与肿瘤的微环境有着密切的关系，在癌症的进展中发挥着协同的作用。研究证实AnnexinA2基因在PTC组织中是新型的生物学标志物，是PTC早期发病和淋巴结转移的重要标志性蛋白之一〔6，17〕。

在肿瘤中，MMPs通过降解细胞外基质(ECM)屏障，参与调控肿瘤侵袭和转移的能力〔18〕。MMP-2、9是MMPs重要的酶，主要作用是使肿瘤细胞获得转移的能力从而浸润周围的组织〔19〕。在PTC中MMP-2和MMP-9存在异常高表达，是肿瘤发生的重要标志性蛋白，且与肿瘤的浸润程度和淋巴结的转移呈现正相关〔20～23〕。在PTC中，细胞周期蛋白cyclinD1与细胞周期G1有关，c-myc在甲状腺癌呈现高表达，c-myc 和cyclinD1是与肿瘤增殖活性密切相关的蛋白〔24，25〕。研究表明 Wnt/β-catenin信号通路参与多种肿瘤进展中细胞增殖、侵袭和转移能力，而 β-catenin是Wnt信号通路中关键因子，在PTC中与肿瘤淋巴结转移有着密切的关系〔26，27〕。本研究表明沉默AnnexinA2基因后可以抑制细胞增殖、侵袭和转移能力，下调c-myc、cyclinD1、MMP-2和MMP-9的表达水平，其机制可能通过Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

本研究表明通过脂质体转染小干扰RNA可特异性敲除K1细胞中AnnexinA2的表达，并且Wnt/β-catenin信号通路调控肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力，AnnexinA2基因极有可能是PTC新的候选靶点，从而为临床早期诊断和生物学靶向治疗研究提供理论基础。有关AnnexinA2基因在PTC中肿瘤微环境、细胞增殖分化和信号通路的转导有待于进一步研究。