结肠癌组织SATB2、SIRT1、HOTAIR表达及与预后的相关性

吴泉霖，马福军，李肖亮

结肠癌目前主要治疗方案为根治性手术结合辅助性放化疗，但有20%～50%的患者术后出现复发或转移，5年生存率仅57%，故研究结肠癌复发和转移危险因素和分子机制对改善预后有重要意义[1-3]。特定富含AT碱基DNA序列结合蛋白2(SATB2)为核基质相关蛋白，对基因重组和染色质重构具有调节作用，近年研究表明其与多种恶性肿瘤发生和进展存在密切联系[4]。沉默信息调节因子1(SIRT1)可调节哺乳动物体内信号传导，对肿瘤细胞凋亡具有抑制作用，与结肠癌发病密切相关，且是导致化疗耐药的重要原因，因此可能对结肠癌预后造成影响[5]。同源盒基因转录反义RNA(HOTAIR)为首个被发现参与实体肿瘤发生和进展的长链非编码RNA，文献报道其与肿瘤细胞侵袭能力密切相关并可导致患者预后不良[6]。本研究以结肠癌患者为样本分析癌组织SATB2、SIRT1和HOTAIR表达水平及其与预后的相关性，为寻找结肠癌分子标志物或治疗靶点提供循证医学证据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月—2016年6月我院诊治符合纳入及排除标准的102例结肠癌，其中男58例，女44例；年龄31～87(58.16±9.45)岁。肿瘤直径1.2～8.5(3.94±1.27)cm；病理类型：管状腺癌79例，黏液腺癌23例；分化程度：高分化14例，中分化37例，低分化43例，未分化8例；美国癌症联合委员会(AJCC)临床分期[7]：Ⅰ期20例，Ⅱ期29例，Ⅲ期40例，Ⅳ期13例。纳入标准：①符合《中国结直肠癌诊疗规范(2015版)》[8]且经病理活检明确诊断；②年龄≥18岁；③入院前未接受手术、放化疗或靶向治疗者；④基础健康状况良好且预计生存期>6个月；⑤患者及家属完全知晓本研究内容并签署同意书。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②合并其他可对患者预后造成影响的重大疾病者；③临床资料或随访结果欠缺者。

1.2研究方法 采集所有患者性别、年龄、既往病史和随访等资料，根据随访结果将患者分为死亡组和存活组，经手术或肠镜获取2组肿瘤组织并检测SATB2、SIRT1及HOTAIR表达水平，分析SATB2、SIRT1和HOTAIR表达与结肠癌患者预后的关系。

1.3治疗和随访 所有患者完善相关检查后根据AJCC分期、基础健康状态和自身意愿选择手术、放化疗或靶向治疗。采用电话、微信或门诊等方式随访，随访截止时间为2021年6月30日，每3个月随访1次，记录患者预后及总体生存期(OS)，OS为从治疗开始至因该疾病导致患者死亡的时间。

1.4SATB2和SIRT1表达水平检测 取部分结肠癌组织经常规固定、脱水和石蜡包埋后采用Finesse 325型切片机(德国Thermo Shandon公司)制作4 μm切片，72 ℃烘烤4 h后高压抗原修复，蒸馏水冲洗并以过氧化氢封闭6 min，再采用PBS液(北京鼎国生物技术公司)冲洗。向切片滴加SATB2和SIRT1一抗(美国Santa Cruz公司)，4 ℃孵育过夜后以PBS液冲洗3次，加入二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)并室温孵育60 min，然后再采用PBS液冲洗3次，DAB显色剂(武汉博士德生物工程公司)染色和苏木素(武汉博士德生物工程公司)复染，蒸馏水冲洗3次后常规脱水、透明和封片，完成后光镜下观察SATB2和SIRT1表达水平。SATB2定位于胞核，SIRT1定位于胞质和胞核，观察10个高倍镜视野下染色细胞占比和染色强度，并采用半定量法计算。阳性细胞百分比<5%为0分、5%～25%为1分、25%～50%为2分、50%～75%为3分、≥75%为4分，染色强度无色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分，两部分得分相乘为总分，以总分0～2分为阴性，≥3分为阳性。阳性对照为美国Santa Cruz公司提供的阳性切片，阴性对照为PBS液代替一抗。

1.5HOTAIR表达水平检测 将结肠癌组织研碎后加入Trizol试剂(日本宝生物工程株式会社)并在4 ℃环境以12 000 r/min离心15 min，取上清液置于新离心管中，加入异丙醇后静置8 min，然后再于4 ℃环境以12 000 r/min离心10 min，去除上清液后加入75%乙醇溶液1 ml，混匀后于4 ℃环境以7500 r/min离心5 min，去除上清液并吸取剩余乙醇，加入无DEPC水溶液(天津艾勒科技有限公司)待检。应用逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)将RNA逆转录为cDNA，并采用荧光定量PCR技术检测HOTAIR表达量，反应体系共10 μl，包括Premix Taq 5 μl，上下游引物各0.2 μl，模板2 μl，dNTP 2.4 μl和ROX DyeⅡ 0.2 μl，引物由上海生工生物有限公司设计，上游序列为5'-GCCTGAACTTCCTCCTGCTATT-3'，下游序列为5'-ACACAAAGTGCATACCTACCCA-3'。反应条件为95 ℃/2 min，95 ℃/15 s，58 ℃/30 s，共循环40次，反应完成后采用2%琼脂糖凝胶电泳并绘制PCR产物熔解曲线，以GAPDH为内部参照，采用2-ΔΔCt法计算HOTAIR相对表达量。

2 结果

2.1不同预后结肠癌患者基本资料比较 本研究中位随访时间为72个月，102例随访期间死亡67例，病死率为65.69%，中位OS为63个月。死亡组肿瘤最大径和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期患者占比均大于存活组，肿瘤分化程度低于存活组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 不同预后结肠癌患者基本资料比较[例(%)]

2.2不同预后结肠癌患者SATB2、SIRT1及HOTAIR表达情况比较 死亡组SATB2阳性率低于存活组，SIRT1阳性率和HOTAIR mRNA相对表达量高于存活组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 不同预后结肠癌患者SATB2、SIRT1及HOTAIR表达情况比较

2.3结肠癌患者预后多因素Cox回归分析 多因素Cox回归分析显示，肿瘤低分化、AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期、SIRT1阳性和HOTAIR mRNA为结肠癌患者死亡的危险因素，SATB2阳性为结肠癌患者死亡的保护因素(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表3 结肠癌患者预后多因素Cox回归分析

2.4结肠癌患者生存情况分析 SATB2阳性患者中位OS(69个月)长于SATB2阴性患者(54个月)，SIRT1阳性患者中位OS(57个月)短于SIRT1阴性患者(78个月)，HOTAIR mRNA≥47.85患者中位OS(57个月)短于HOTAIR mRNA<47.85患者(78个月)，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图1。

图1 结肠癌患者生存曲线

3 讨论

结直肠癌是胃肠道常见恶性肿瘤[9-11]，好发于40～50岁男性，据WHO报道显示2018年新增和死亡患者数量分别约为180万人和88万人，发病率居男性恶性肿瘤第3位，居女性恶性肿瘤第2位[12]。结肠癌发病受基因、环境和饮食习惯等多种因素影响，近年来我国居民因生活水平逐渐改善和饮食结构变化，使得结肠癌发病率明显升高[13-16]。

目前结肠癌患者整体预后仍不乐观。本研究随访显示，102例中位OS为63个月，与李荣振等[17]报道结果相近。同时本研究分析显示，死亡组肿瘤最大径和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期患者占比大于存活组，肿瘤分化程度明显低于存活组，提示体积增大、临床分期增加及分化程度降低均可能导致预后不良。MARKS等[18]分析认为，虽然近年来分子检测在结直肠癌中的应用逐渐增多，但是临床和病理资料仍是治疗方案选择和预后判断的主要依据。本研究多因素Cox回归分析结果显示，肿瘤低分化和AJCC分期Ⅲ+Ⅳ期为结肠癌患者死亡的危险因素。

随着医学水平快速发展和对结肠癌认识的不断加深，发现SATB2、SIRT1和HOTAIR与结肠癌存在密切联系。SATB2包括733个氨基酸，可与富含AT的DNA序列特异性结合并调控基因转录和重组，且其作为抑癌基因可参与调节肿瘤细胞免疫、转移和凋亡等生物学行为，表达缺失可导致结肠癌分化程度降低[19]。本研究结果显示，死亡组SATB2阳性率低于存活组，多因素Cox回归分析显示SATB2为结肠癌患者死亡的保护因素，原因可能与SATB2阳性表达有利于促进肿瘤细胞分化并降低转移发生风险密切相关。SIMONS等[20]认为SIRT1参与了结肠癌的发展过程，其基因突变可能影响结肠癌发病风险。本研究死亡组SIRT1阳性率明显高于存活组，且多因素Cox回归分析显示SIRT1阳性为结肠癌患者死亡的危险因素，分析原因为SIRT1可通过磷酸化激活肿瘤细胞JNK、ERK和AKT等多种信号通路并促进细胞增殖，从而导致病情进展和预后不良。有研究认为长链非编码RNA在肿瘤发生和进展中发挥重要作用，其中HOTAIR与结肠癌细胞LoVo迁移能力密切相关[21]。本研究结果显示，死亡组HOTAIR mRNA相对表达量明显高于存活组，且多因素Cox回归分析显示患者死亡风险随着其表达水平的升高呈上升趋势。同时本研究采用Log Rank法分析显示，SATB2阴性、SIRT1阳性和HOTAIR mRNA≥47.85的结肠癌患者中位OS明显缩短，提示检测结肠癌组织SATB2、SIRT1和HOTAIR表达水平对判断患者预后具有一定参考价值。

综上，结肠癌组织SATB2、SIRT1和HOTAIR表达均为影响患者预后的重要因素。