过表达FOXB2对肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响

梁俊辉 陈泽锐 彭树明 陈善嘉 舒柏荣

【摘要】 目的 探讨叉头框蛋白B2（FOXB2）对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法 采用定量PCR检测正常肝细胞LO2细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞FOXB2 mRNA的表达，构建过表达FOXB2的细胞模型，逆转录实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测过表达效率，细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测FOXB2对Huh7细胞增殖能力的影响;平板克隆实验检测FOXB2对Huh7细胞克隆形成能力的影响;Transwell实验检测FOXB2对Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响。结果 FOXB2在肝癌细胞系Huh7和Hep3B细胞中的表达水平低于正常肝细胞LO2（P<

0.001）;过表达FOXB2抑制了Huh7细胞的增殖（P=0.005）和克隆形成（P<0.001）;FOXB2过表达肝癌细胞的迁移（P<0.001）和侵袭（P=0.002）能力低于Vector对照细胞。结论 FOXB2在肝癌细胞中低表达，FOXB2过表达抑制了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

【关键词】 肝细胞癌;叉头框蛋白B2;增殖;侵袭;迁移

Effect of overexpression of forkhead box B2 on proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells Liang Junhui△， Chen Zerui， Peng Shuming， Chen Shanjia， Shu Bairong. △Department of General Surgery， Guangdong Provincial People’s Hospital Nanhai Hospital， Foshan 528200， China

Corresponding author， Shu Bairong， E-mail： shubrmd@163.com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of forkhead box protein B2 （FOXB2） on the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods The expression levels of FOXB2 mRNA in normal liver cells LO2， hepatocellular carcinoma cells Hep3B and Huh7 were detected by quantitative PCR. The cell model overexpressing FOXB2 was constructed. The overexpression efficiency was assessed by real-time fluorescent quantitative PCR and Western blot. The effect of FOXB2 on Huh7 cell proliferation was evaluated by cell counting kit-8 （CCK-8）. The effect of FOXB2 on the clone formation of Huh7 cells was determined by plate cloning assay. The effect of FOXB2 on the invasion and migration of Huh7 cells was detected by Transwell chamber test. Results The expression levels of FOXB2 in hepatocellular carcinoma cells Huh7 and Hep3B were significantly lower than that in normal liver cells LO2 （both P<0.001）. Overexpression of FOXB2 significantly inhibited the proliferation （P=0.005） and clone formation （P<0.001） of Huh7 cells. In the Huh7-FOXB2 overexpression group， the invasion （P=0.002） and migration capabilities （P<0.001） of hepatocellular carcinoma cells were significantly lower than that in the Vector control cells. Conclusions FOXB2 is lowly expressed in hepatocellular carcinoma cells. Overexpression of FOXB2 suppresses the proliferation， invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells.

【Key words】 Hepatocellular carcinoma; Forkhead box protein B2; Proliferation; Invasion; Migration

目前肝細胞癌（肝癌）是病死率较高的恶性肿瘤之一[1]。尽管近年肝癌的基础和临床研究取得较大进展，但肝癌患者的5年生存率仍然很低[2]。现有的多种疗法依然具有明显不良反应[3]。寻找早期诊断的生物标志物和潜在的治疗靶点，对改善肝癌患者的预后是十分必要的。果蝇胚胎中转录调控因子叉头框蛋白（FOX）在控制细胞周期、上皮分化和代谢以及调节免疫系统等许多生物学过程中有重要的作用，且具有肿瘤抑制和潜在致癌的双重作用。FOXB2是FOX蛋白家族的重要成员之一，研究显示FOXB2抑制了胰腺癌细胞Panc-1的恶性表型[4]。FOXB2在肝癌中的作用笔者尚未见有相关报道，为此进行本研究，旨在阐明FOXB2在肝癌中的作用。

材料与方法

一、试剂与耗材

胎牛血清（FBS）、双抗抗生素、高糖DMEM培养基、Opti-MEM培养基、Lipofectamine 3000转染试剂购自赛默飞;细胞培养板（6、24、96孔板）、Transwell小室（8 μm）购自Corning公司;细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、RIPA裂解液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、增强型电化学发光（ECL）试剂购自上海碧云天生物技术有限公司;RNAiso Plus试剂、TB Green® 逆转录快速荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂购自宝生物工程有限公司;FOXB2抗体购自Immunoway公司;GAPDH抗体购自Santa Cruz Biotechnology;辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗购自北京锐抗生物科技有限公司;0.22 μm的聚偏氟乙烯（PVDF）膜购自Millipore公司;结晶紫购自Sigma-Aldrich公司。

二、方 法

1. 细胞培养

正常肝细胞LO2细胞和肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞购自中国科学院细胞库，采用含10%FBS的DMEM培养细胞，添加10 000 kU/L的链霉素和10 000 kU/L青霉素于培养基中。于细胞培养箱进行细胞培养，待细胞融合至90%时进行传代，隔日进行细胞换液。

2. qRT-PCR检测细胞mRNA表达水平

按照说明书应用RNAiso Plus试剂从细胞中获取总RNA，NanoDrop测定RNA浓度。RT体系为10 μL，模板DNA产物常规稀释10倍;采用TB Green® Fast qPCR Mix试剂进行qRT-PCR检测mRNA的表达水平。引物由华大基因合成。引物序列：GAPDH上游5’-CTACACTGAGCACCAGGTG

GTC-3’，下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG

-3’，产物长度115 bp;FOXB2上游5’-GCTGAGCG

ACATCTACAAGTTC-3’，下游5’-GAATCTTGATG

AAGCAGTCGTTG-3’，产物长度119 bp。2-ΔΔCt法计算目的mRNA相对表达量，实验重复3次。

3. 构建过表达FOXB2细胞系

转染空载体质粒的Huh7细胞为Vector组，转染FOXB2重组质粒的Huh7细胞为FOXB2组;细胞转染的前一日，消化收集细胞，计数后铺于24孔板;细胞转染当日，取Opti-MEM稀释质粒;加入Lipofectamine 3000，培养20 min;取Lipofectamine 3000在Opti-MEM中稀释;将混合液加入对应各孔中后摇匀;继续培养48 h后检测FOXB2 mRNA和蛋白的表达水平。

4. 蛋白免疫印迹法检测细胞蛋白表达水平

预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞15 min。BCA法测定蛋白浓度。95℃变性5 min，10%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白质，0.22 μm PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，抗体（FOXB2 1∶1000;GAPDH 1∶1000）4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次8 min，抗体室温孵育2 h;TBST洗涤3次，每次8 min，使用增强ECL底物在BIO-RAD Chemidoc XRS凝胶成像系统曝光;使用Image J进行图像分析。

5. CCK-8法检测细胞增殖能力

96孔板每孔加入100 μL细胞悬液（含有5×103个细胞），每组3个复孔，不含细胞的培养基作为空白对照（Vector）;然后分别于预先制定好的检测时间点（24、48、72 h），向检测孔中加入10 µL的CCK-8试剂，继续在培养箱中培养2 h，于酶标仪上在450 nm处测定吸光度（D450）。实验重复3次。

6. 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

取Vector对照组和FOXB2过表达组的细胞以1×103 /孔的密度铺板6孔板，继续培养1周，4%多聚甲醛固定细胞后用0.2%结晶紫染色，相机拍照并计数克隆个数。实验重复3次。

7. Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力

按试剂盒说明书将5×104细胞接种在24孔板中。预定时间收集细胞并将其悬浮在无血清培养基中。迁移能力时将细胞置于未涂Matrigel胶的上腔室中。侵袭实验测定时将上室的膜按1∶8稀释并涂Matrigel胶。所有下腔室均充满500 µL含25%FBS的培养基。将细胞置于上室培养24 h后，在200倍物鏡下使用显微镜在3个视野中对迁移或侵袭的细胞数量进行计数。

三、统计学处理

使用GraphPad Prism 7处理数据。结果以 表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、LO2、Hep3B、Huh7细胞中FOXB2 mRNA相对表达量比较

人肝癌细胞系Hep3B、Huh7细胞的FOXB2 mRNA表达水平低于人正常肝细胞LO2细胞（F = 321.6，P < 0.001），见图1。

二、FOXB2过表达对Huh7细胞增殖的影响

转染后的qRT-PCR检测结果显示，与Vector组细胞相比，FOXB2组细胞的FOXB2 mRNA（t = 21.85，P < 0.001）和蛋白（t = 7.19，P = 0.002）相对表达量均明显上调，见图2A～C。CCK-8实验显示，过表达FOXB2在72 h明显抑制了Huh7细胞的增殖能力（t = 5.61，P = 0.005），见图2D。

三、FOXB2过表达对Huh7细胞克隆形成的影响

平板克隆形成实验结果显示，过表达FOXB2明显抑制了Huh7细胞的克隆形成能力（t = 19.41，P < 0.001），见图3。

四、FOXB2过表达对Huh7细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell迁移实验结果显示，过表达FOXB2明显抑制了肝癌细胞Huh7的迁移（t = 7.32，P = 0.002）和侵袭（t = 10.58，P < 0.001） 能力，见图4。

讨 论

肝癌仍然是危害人类健康的公共卫生难题之一，在全球范围内仍然有增加的趋势[1]。尽管近年肝癌的诊断和治疗研究方面均取得了长足的进展，但其5年生存率仍然较低，主要原因为肝癌早期临床表现缺乏特异性，大部分肝癌患者在确诊时已处于中晚期，肿瘤细胞已经发生转移，而转移及相关并发症是造成肝癌患者死亡的主要原因[5]。肝癌患者根治性切除术后5年累积复发率约为70%，有大约90%的患者因发生转移而死亡[6]。因此，深入研究肝癌的具体分子机制仍然是该领域的重点。

FOX蛋白家族由一组进化上保守的转录因子组成，其特征是一个共同的DNA结合域，称为叉头盒结构域。该家族包括19个亚族，具有翼状螺旋DNA结合结构域或称叉头结构域，这种结构域具有转录激活和抑制作用，使FOX具有肿瘤抑制和潜在致癌的双重作用。FOX蛋白家族参与细胞生长、分化和其他生物过程。FOX蛋白家族转录因子的解除调控对肿瘤的发生和发展具有重要意义。在人类中，根据序列相似性，FOX基因被分为19个亚组。在癌细胞中，许多FOX基因被认为是抑癌基因或促癌基因。例如，FOXO和FOXM1转录因子的平衡通过竞争性调节靶基因胰岛素样生长因子，整合了腺苷5’-磷酸腺苷，活化蛋白激酶介导的代谢和细胞周期调节。FOXK1和FOXK2在调节线粒体功能、代谢和凋亡中起重要作用[7]。作为FOX家族蛋白的一员，BRAF突变阳性的结直肠癌中FOXB2的5’区CpG岛存在异常甲基化。Fukuchi等[4]研究显示，FOXB2在胰腺癌细胞系Panc-1细胞中低表达，其5’端的CpG岛高度甲基化，表明FOXB2可能受到抑制，进一步研究发现FOXB2抑制了Panc-1细胞的恶性特征。

本研究显示，与正常肝细胞相比，FOXB2在肝癌细胞中低表达;过表达FOXB2抑制了肝癌细胞的增殖和克隆形成能力，同时降低了肝癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究初步探讨了FOXB2在肝癌中的作用，为后续的研究奠定了一定的基础，但FOXB2在肝癌中的具体作用机制依然不明确，日后将进一步研究FOXB2在肝癌中的具体分子机制。为改善肝癌患者的预后，发现新的肝癌药物干预靶点提供理论依据。

参 考 文 献

[1] Bray F， Ferlay J， Soerjomataram I， et al. Global cancer statistics 2018： GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin， 2018， 68（6）：394-424.

[2] Erstad D J， Tanabe K K. Prognostic and therapeutic implications of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma. Ann Surg Oncol， 2019， 26（5）：1474-1493.

[3] Lee D H， Lee J M， Kim P N， et al. Whole tumor ablation of locally recurred hepatocellular carcinoma including retained iodized oil after transarterial chemoembolization improves progression-free survival. Eur Radiol， 2019， 29（9）：5052-5062.

[4] Fukuchi H， Hayashida Y， Inoue K， et al. Forkhead box B2 inhibits the malignant characteristics of the pancreatic cancer cell line Panc-1 in vitro. Genes Cells， 2019， 24（10）：674-681.

[5] Villanueva A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med， 2019， 380（15）：1450-1462.

[6] Rankin E B， Giaccia A J. Hypoxic control of metastasis. Science， 2016，352（6282）：175-180.

[7] Sakaguchi M， Cai W， Wang C H， et al. FoxK1 and FoxK2 in insulin regulation of cellular and mitochondrial metabolism. Nat Commun， 2019， 10（1）：1582.

（收稿日期：2021-05-18）

（本文編辑：林燕薇）