不同耐/感玉米自交系对高温胁迫的响应及其恢复力

谢 艺，倪艳林，朱 航，朱叶青，张 艳，邹华文，张丙林

（长江大学农学院，湖北 荆州 434023）

玉米是重要的粮食作物和饲料作物，其种植面积和总产量仅次于水稻和小麦。虽然玉米在整个生育期内需要较高的温度，但超过3 d 最高气温≥35 ℃的持续高温天气，则会影响植株的生长和发育，造成高温热害。中国南方地区的夏玉米在幼苗生长期间易遭遇高温天气，造成发育异常而减产。随着全球工业化发展和温室气体排放的加剧，季节性高温发生的频率预计在未来几十年内会增加［1，2］。全球气候变暖将对夏玉米的生产带来很大的负面影响［3］。

如果植物生长发育过程中受到高温胁迫，其器官生理生化以及分子反应过程等均会产生响应。光合作用是植物物质转化和能量代谢的关键，遭遇高温后，由于叶片叶绿素含量减少，类囊体上的光化学反应和叶绿体基质上的碳代谢受到影响，从而造成玉米叶片光合作用能力下降，有机物合成量减少［4，5］。高温胁迫导致植株叶片光合速率下降与其气孔状态有很大的关系，另外，叶片的蒸腾速率随着气孔的开闭而变化，受到高温胁迫时，植株为防止叶温过高而加快蒸腾来减少热损伤。气孔状态也是影响植株叶片水分利用率的重要因素，有学者通过研究小麦叶片的气孔发现，气孔面积和气孔孔径宽度对水分利用率的影响很大［6］。

气孔是植物碳同化、呼吸和蒸腾作用等气体代谢的通路，在生理上具有重要意义［7］。植物通过改变气孔的开度、大小、气孔频度（密度和指数）和气孔与表皮细胞的分布状态来适应各种生理逆境［8-11］。目前，关于高温胁迫对气孔的影响的研究相对较少，且结果不一致，一般认为高温对植物叶片的气孔性状没有影响［12-15］，但也有研究认为高温可以改变气孔状态，比如气孔密度、气孔孔径宽度和气孔导度等。植物叶片的气孔密度与其气体交换过程密切相关，Song 等［16］、张立荣等［17］做了关于拟南芥和不同蒿类矮生草甸的研究，发现这些植物气孔密度随着温度的升高而降低；朱玉等［18］对蓝莓幼苗的研究结果表明，高温对气孔密度的影响因品种而异，部分品种的气孔密度随温度增加而增加，也有一些品种的气孔密度没有变化；Jumrani 等［19］研究发现，随着温度的升高，大豆叶片远轴面和近轴面的气孔数量均显著增加，蒸腾速率加快。此外，气孔孔径宽度和气孔导度决定了单个气孔的CO2通过量，Zhang 等［20］研究了不同浓度CO2和温度的交互作用对番茄叶片气孔孔径的影响，发现在高浓度CO2条件下，高温导致番茄叶片气孔孔径宽度减小，最终使水分散失和植株耐热性之间达到平衡；梁雯［21］通过研究高温对杜鹃叶片气孔及光合特性的影响，发现高温导致其气孔导度改变，从而降低细胞间隙CO2摩尔分数、净光合速率、蒸腾速率及水分利用率。

目前，不同耐/感玉米自交系苗期的植株性状、气体交换过程和气孔特性对高温胁迫的响应及其恢复状态尚不清楚。因此，根据前期筛选的结果，利用人工气候室模拟增温，对耐热性差异较大的2 个玉米自交系进行研究，以玉米苗期高温胁迫及恢复的基因型差异为切入点，研究高温胁迫对玉米苗期叶片气孔特性和气体交换参数的影响以及高温条件下它们之间的关系，旨在为丰富耐热型玉米种质资源提供理论依据，有助于为未来气候变化下的夏玉米生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 植株培养及处理

供试玉米材料为前期研究中筛选出的耐热型自交系13HF1849 和敏感型自交系14HF1406。选取子粒饱满且大小一致的种子，用质量分数为0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，然后用去离子水冲洗干净后放入烧杯，加温水没过种子浸泡8 h，再用去离子水冲洗，将种子放入铺有滤纸的培养皿，加去离子水至淹没滤纸并有浅水层，在28 ℃恒温培养箱催芽。

取试验田耕层土壤晒干后过1 cm 筛，每盆（直径16 cm，高17 cm）加200 g 有机质、4 g 过磷酸钙和12 g 氯化钾混合，将混合后的土装至盆钵刻度线，每个自交系各选择10 粒生长发育良好的种子移栽至盆钵，在人工气候室中培育（昼/夜气温：26/23 ℃，白天/夜间光周期：14/10 h，湿度60%，CO2浓度为450～480 mg/kg）。

在植株即将进入六叶一心期时，分别放入38 ℃（HT）和28 ℃（CK）条件下处理［22，23］，其他环境参数不变。当每盆植株在第7 片叶完全展开时，测量该叶片的生理指标、光合、气孔、气体交换等参数。然后将2 组植株放入常温（28 ℃）条件下恢复，直到第9片叶完全展开，再次测量第9 片叶的所有参数。

1.2 测定内容与方法

1.2.1 植株性状的测定 在试验期内，记录每片叶完全展开所需天数，以计算出叶速率，出叶速率为完全展开叶片的数量除以叶片完全展开所需的天数；待植株第7 片叶与第9 片叶完全展开后，用卷尺测量株高，并用Li-3000 型叶面积仪测定第7 片叶与第9片叶的叶面积；用SPAD502 型叶绿素仪测量叶基部、叶中部和叶尖3 个部位的叶绿素相对含量，每个部位重复测定5 次，求其均值。

1.2.2 气体交换参数的测定 当植株生长至第7 片叶与第9 片叶完全展开后，用Li-6400 型便携式光合测定系统测定每盆植株第7 片叶与第9 叶叶基部、叶中部和叶尖部的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率等气体交换参数，测量时的叶室环境条件为光照度1 000 μmol/（m2·s），湿度60%，温度为38/28 ℃，CO2浓度为480 mg/kg，植株的稳定时间为2.5～5.0 min。以叶基、叶中、叶尖3 个部位的均值为最终参数。瞬时水分利用效率为净光合速率与蒸腾速率的比值，潜在水分利用效率为净光合速率与气孔导度的比值［24］。

1.2.3 气孔性状的测定 与气体交换参数测定的时间和叶片一致，采用印迹法取样，在每盆植株第7 片叶与第9 片叶的叶基部、叶中部和叶尖部位涂上无色透明的指甲油，采集面积为20 mm×10 mm，用胶头滴管在载玻片上滴一滴去离子水，待叶片上的指甲油风干后，用镊子撕下薄膜放在载玻片的水滴上，展开铺平，盖上盖玻片，自然晾干备用。

将带有气孔印记样品的载玻片用装备有相机的Nikon 显微镜观察（YS100 型，尼康株式会社），随机选择3 个视野拍照，每个视野拍3 张照片，利用配套软件系统对每张照片的气孔密度、表皮细胞密度进行统计和计算，每张照片选取10 个气孔测量气孔孔径宽度、气孔最大长度、气孔最大宽度以求气孔面积。气孔和表皮细胞密度表示为单位面积内气孔和表皮细胞的数量。气孔孔径宽度是指气孔两端保卫细胞连接处之间的长度。气孔面积=气孔最大长度×气孔最大宽度×3.14×0.25。

1.3 数据处理与分析

数据均采用Microsoft Excel 和DPS 统计软件进行分析。用Pearson 相关性检验分别分析了高温条件下气孔的性状与光合生理参数的关系。采用t检验分析了高温与对照各参数的差异。

2 结果与分析

2.1 不同耐/感玉米自交系植株及叶片生理指标对高温的响应及其恢复

由图1、图2 可知，与对照组相比，高温处理使热敏感型自交系植株第7 片叶的叶面积、株高和SPAD分别下降了39、33 和31 个百分点，下部叶片出现大面积的萎蔫、褐化和黄化，部分新叶也逐渐呈相似趋势，生长明显受到抑制；相反，耐热型自交系受高温影响较小，在高温条件下的生长趋势与常温对照相比无较大差异，SPAD甚至增加了9 个百分点。2 个自交系的出叶速率均受到显著影响，呈减缓趋势。

图1 高温处理及常温恢复对耐热型自交系13HF1849（a、b）和热敏感型自交系14HF1406（c、d）植株表型的影响

图2 高温处理及常温恢复对耐热型自交系13HF1849 和热敏感型自交系14HF1406 叶面积（a、b）、株高（c、d）、叶绿素相对含量（e、f）和出叶速率（g、h）的影响

经过28 ℃恢复期后，2 个自交系第9 片叶仅出叶速率能与常温对照保持一致，热敏感型自交系由于高温处理导致的叶面积、株高和SPAD并没有随着温度降低而恢复，但是耐热型自交系的叶面积和株高呈缓慢回升的趋势。

2.2 不同耐/感玉米自交系气体交换参数对高温胁迫的响应及其恢复

如图3 所示，与常温对照相比，高温导致热敏感型自交系的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、潜在水分利用效率（iWUE）和气孔导度（Gs）分别下降25、17、2 和24 个百分点；而耐热型自交系呈相反趋势，Pn、Tr、iWUE和Gs分别增加12、49、25 和41 个百分点，且均高于热敏感型自交系，其中Tr和Gs最为显著；但是，高温胁迫使2 个自交系的瞬时水分利用效率（WUE）显著降低，且耐热型自交系的WUE低于热敏感型自交系。经过常温恢复期后，与对照相比，热敏感型自交系高温处理组（第9 片叶）的所有气体交换参数均有不同程度的下降，但耐热型自交系的Tr、iWUE和Gs仍高于对照组。

图3 高温处理及常温恢复对耐热型自交系13HF1849 和热敏感型自交系14HF1406 气体交换参数的影响

2.3 不同耐/感玉米自交系叶片气孔特征对高温的响应及其恢复

2 个玉米自交系的气孔特性对高温胁迫的响应一致，如图4 所示，与对照组相比，高温处理导致2 个自交系的气孔密度（SD）、气孔孔径宽度（SW）和气孔面积（SA）均显著增加。耐热型自交系和热敏感型自交系的SD分别比对照组增加了30 和27 个百分点，SW分别增加了26 和23 个百分点，SA分别增加了39 和77 个百分点，且热敏感型自交系所有的气孔参数均低于耐热型自交系。经过28 ℃常温恢复后，耐热型自交系和热敏感型自交系第9 片叶的SD 分别高于对照组39 和63 个百分点，但此时的SW 和SA低于对照组。

图4 高温处理及常温恢复对耐热型自交系13HF1849 和热敏感型自交系14HF1406 叶片气孔特征的影响

2.4 高温条件下不同耐/感玉米自交系的净光合速率和潜在水分利用效率与气孔参数和SPAD 之间的关系

由图5、图6 可知，在高温条件下，2 个试验材料的净光合速率分别与气孔导度、SPAD和气孔孔径宽度之间存在显著或极显著正相关关系，而潜在水分利用效率仅与气孔导度和气孔孔径宽度呈显著或极显著正相关关系。耐热型自交系的净光合速率与气孔导度和SPAD之间的相关性较高，而热敏感型自交系的净光合速率与气孔孔径宽度和SPAD之间的相关性较高。耐热型自交系的潜在水分利用效率与气孔导度和气孔孔径宽度之间的相关性较高，热敏感型自交系的潜在水分利用效率与气孔孔径宽度之间的相关性也较高。

图5 高温条件下耐热型自交系13HF1849 和热敏感型自交系14HF1406 不同指标与净光合速率的相关性

图6 高温条件下耐热型自交系13HF1849 和热敏感型自交系14HF1406 不同指标与潜在水分利用效率的相关性

3 讨论

研究结果表明，不同耐/感玉米自交系对高温胁迫的响应不同，38 ℃高温使热敏感型自交系苗期的叶面积、株高、叶绿素相对含量和出叶速率呈下降趋势。这与前人的研究结果相似，当温度上升到28 ℃以上时，植株生长开始受到影响，当日平均温度在30 ℃或35 ℃以上时，株高、总生物量、叶绿素含量和比叶面积呈线性下降［25，26］，40 ℃是玉米营养生长阶段的温度极限［27］。由于高温导致叶绿素降解，从而造成植株叶片黄化，有机物合成量减少，最终影响到生物量［28］。而高温条件下耐热型自交系的叶面积、株高和植株生长状况与常温对照相比没有显著差异，叶绿素相对含量甚至呈上升趋势。由此推测，不同温度条件下植株叶面积和株高等表型生长参数存在显著差异可能与2 个自交系的光合性能有关。

本研究结果表明，热敏感型自交系的净光合速率下降了25 个百分点，而耐热型自交系的净光合速率上升了约12 个百分点。一些学者在早期进行了类似研究，发现高温处理后常规番茄品种的净光合速率显著降低，而抗性品种植株在遭遇高温胁迫后没有出现降低的趋势［29］。本研究中出现了抗性自交系的光合速率不降反升的结果，或许与其气孔特性有关。吴冰洁［30］通过研究玉米和高粱的气孔发现，无论是近轴面还是远轴面的气孔受到抑制，都会导致光合速率降低，且抑制远轴面气孔会导致光合速率降低幅度更大，不同作物及其不同品种植株的气孔对环境的敏感性差异可能是通过改变CO2分压来影响其垂直扩散。

前人的研究认为，气孔孔径和气孔导度分别与净光合速率和水分利用效率呈负相关关系，而与蒸腾速率呈正相关关系［20］。在不同水分条件下，气孔导度分别与净光合速率和潜在水分利用率呈负相关关系［31］。植物叶绿素含量和光合作用性能之间也存在相关性，叶绿素含量越高，玉米叶片的净光合速率越高，气孔导度和蒸腾速率越大［32，33］。通过分析本研究结果之间的相关关系发现，在高温条件下，2个玉米自交系的净光合速率分别与气孔导度、气孔孔径宽度和叶绿素相对含量呈显著或极显著正相关关系，而潜在水分利用效率与气孔导度和气孔孔径宽度呈显著或极显著正相关关系。

本研究中，增温降低了敏感型自交系的潜在水分利用率和蒸腾速率，而耐热型自交系则呈相反的趋势。高温条件下光合性能、蒸腾和水分利用效率变化的主要原因可能是热胁迫引起的气孔状态变化（气孔密度、气孔孔径宽度和气孔面积）。有学者认为，气孔密度与净CO2同化率和瞬时水分利用效率呈正相关关系［34］。本研究结果表明，高温对2 个供试自交系也产生了类似的影响，在高温胁迫下，自交系的气孔密度、气孔孔径宽度和气孔面积显著增加，且耐热型自交系的基数和增长率均高于热敏感型自交系。因此，耐热型自交系受高温胁迫的影响较小，这可以归因于其较高的散热效率，通过改变气孔数目以及单个气孔的孔径大小和形状来改变叶片气孔分布格局和每片叶的气孔总面积［35］。Feller［36］的研究也得到相似的结果，菜豆叶片在20 ℃到50 ℃下的气孔开度不同，在温度为23、30 和35 ℃时，气孔孔径分别为0.66、2.76 和4.28 μm。此外，气孔导度和孔径大小决定光合作用吸收的CO2量，并通过蒸腾作用控制水分散失量，促进蒸发冷却和养分的吸收［37，38］。本研究结果表明，高温增加了抗性自交系的气孔导度、孔径宽度和SPAD，而热敏感型自交系则表现出相反的结果，这与2 个试验材料的光合特性变化趋势一致。推测2 个自交系在高温条件下的光合特性的差异与其气孔导度、气孔孔径以及SPAD存在联系。

另外，气孔的发育状态也是影响植株光合作用的重要因素，气孔发育可以通过改善气体交换来缓和气孔限制，从而提高光合性能和蒸腾散热。温度是植物感知到的主要环境信号，能诱导一系列发育和形态变化，包括器官生长、花期和气孔数量等［39］。玉米等单子叶植物气孔的发育过程需要经过多个阶段，由表皮原细胞形成保卫细胞母细胞，再逐渐分裂形成保卫细胞和副卫细胞，最终形成成熟的气孔复合体［40］。气孔谱系的前体细胞，即分生组织母细胞（MMC）和分生组织能进行自我更新，这些前体细胞的发育和变化决定了气孔和表皮细胞的数量和比例，同时，也由于形成过程中环境的差异造成一定的气孔大小差异。气孔前体细胞的启动和复制是由SPCH 蛋白驱动的，它可以通过调节多个基因来促进前体细胞的分裂和形态转换，并接收外界信号，影响气孔谱系的活动［41，42］。SPCH 蛋白由MAPK 蛋白激酶和油菜素类固醇（BR）信号通路为靶向，高温等外界胁迫通过降低MAPK 活性来抑制SPCH 蛋白活性，从而影响气孔谱系活动［43，44］。由于SPCH 蛋白在气孔谱系发育中具有重要作用，所以推测，SPCH 或许是高温胁迫导致本研究中2 个自交系气孔导度、密度以及气孔孔径宽度增加的原因。另外，PIF4（Phytochrome-interacting factor 4）是高温感知下游的直接信号，在接收到高温信号后，能够调节气孔发育，缺少PIF4 的植物在高温条件下会表现出缺陷反应。有前人研究了野生型和PIF4 突变体植株对高温的响应，发现野生型植株气孔密度呈下降趋势，而突变体植株在高温条件下的气孔密度与常温对照相比无显著差异，而且高温条件下，PIF4 能促进SPCH充分积累，以确保气孔细胞的分化［45］。因此，推测高温条件下耐热型自交系气孔参数基数大于敏感型自交系，取决于其SPCH 和PIF4 的表达量，但是具体的结果还需进一步研究验证。

本研究中2 个自交系在高温条件下的瞬时水分利用率均显著降低，虽然提高蒸腾速率是保护植物免受高温危害的重要措施之一，但同时也要减少水分损失以实现高效用水。这与前人的一些研究结果相似，适当的高温（35 ℃）可以增加抗性品种的潜在水分利用率，但当温度上升到阈值时（40 ℃）便开始降低，同时，常规品种在35 °C 和40 °C 条件下的潜在水分利用率高于正常温度［24］。本研究的结果虽然不能完全描述成熟或整株植物的反应，但仍然表明，在高温胁迫下，植物经历了防止水分流失和蒸腾散热之间的权衡。

经过常温恢复期后，2 个供试自交系的净光合速率和气孔孔径宽度均低于对照组，抗性自交系的光合参数和气孔参数均高于敏感型自交系。耐热型自交系的蒸腾速率、潜在水分利用效率和气孔导度均高于对照组，而敏感型自交系则呈相反趋势。张洁等［46］通过研究高温及其恢复对光合特性的影响发现，气孔限制因素是高温处理后处于常温恢复期植株光合作用下降的重要原因。在38 ℃的高温条件下，玉米植株发生了一系列变化，即使是经过常温恢复，敏感型自交系的表型特征在短期内难以恢复到正常生长水平，呈持续的热损伤状态。耐热型自交系能很快恢复，或许与其非光化学能量耗散增加和HSP101 蛋白诱导启动光化学修复有关，使其具有更耐热的光合系统以及有效的光合修复机制［47］。

4 小结

与热敏感型自交系相比，耐热型自交系在高温条件下表现出更高的光合和水分利用稳定性，在高温胁迫后恢复更快，这主要是由于耐热型自交系具有较大的气孔导度、气孔孔径宽度和叶绿素含量，使CO2同化率增加，最终使光合效率增强，水分利用率提高。经过常温恢复后，热敏感型自交系在短期内难以恢复到正常生长水平，呈持续的热损伤状态，而耐热型自交系则有更强的恢复适应能力。