高原生境不同水力停留时间下A2/O工艺活性污泥微生物代谢机制研究*

李远威 郝凯越 宗永臣 尤俊豪 郭明哲

(西藏农牧学院水利土木工程学院，西藏 林芝 860000)

目前我国城镇污水处理厂主要采用活性污泥法[1]，其中A2/O工艺由于运行管理简单、脱氮除磷效果好等应用最为广泛。污水处理工艺中脱氮除磷的效能与微生物菌属功能、基因丰度以及各污染物代谢途径紧密相关。康小虎[2]98研究发现，在亚高原地区污水处理工艺中污水种类可影响功能蛋白种类，且丰度较高的酶和基因与微生物参与的碳代谢、氮代谢以及适应环境变化方面的代谢有着密切的联系。黄潇[3]发现，在污水处理好氧区主要发生氮代谢，且水力停留时间(HRT)的延长有利于脱氮菌和有机物降解菌的生长，便于碳源、氮源的降解。彭永臻等[4]在活性污泥中发现固氮酶功能基因nifD，其主要参与的氮代谢途径是生物脱氮的主体。崔迪[5]发现，活性污泥中以碳、氮和磷代谢为主，其中碳代谢提供的碳源确保了微生物群落的基本生长要求，便于后续生物代谢反应的进行。然而，上述研究多在平原或亚高原地区展开，针对高原生境下活性污泥代谢途径和基因丰度等方面的研究较少。西藏自治区位于青藏高原西南部，平均海拔在4 000 m以上，为进一步提升高原生境下污水处理效能，本研究在西藏农牧学院校区内构建A2/O工艺试验装置，考察了在不同HRT条件下污泥系统的优势菌属功能和污染物代谢途径等情况，探讨了微生物代谢功能等规律，以期为高原生境下活性污泥微生物代谢机制的研究提供一定的理论基础。

1 试验和方法

1.1 试验装置

试验采用A2/O工艺小试装置，其中反应池总体积为210 L，其中厌氧池、缺氧池、好氧池体积分别为35、58、117 L，二沉池体积为39 L。试验过程中，厌氧池和缺氧池利用爪极式永磁同步电机配合搅拌器进行搅拌，好氧池利用交直流增氧泵和空气浮子流量计进行曝气[6]。采用磁力驱动循环泵控制污泥回流比为100%，采用蠕动泵控制硝化液回流比为200%。利用好氧池进行35 d的活性污泥培养，培养条件为：温度(20.0±0.5) ℃，溶解氧(DO) 2.0～3.0 mg/L，pH 6.50～7.50。培养阶段结束时，测得污泥沉降比(SV30)为28%，混合液悬浮固体质量浓度(MLSS)为3 716 mg/L，污泥达到预定要求后开展正式试验。本试验直接采用校园生活污水为试验用水，主要进水水质指标见表1。

表1 试验用水水质指标

1.2 试验方法

保持污泥培养阶段时的控制指标不变，利用流量计调节进水流量分别为8、10、12、14 L/h，对应的HRT为26.25、21.00、17.50、15.00 h，每种HRT工况连续运行9 d，每天持续监测进出水COD、TN、TP、氨氮指标，检测方法参照文献[7]。试验结束后对好氧池活性污泥进行取样，预处理后送样检测。为消除工况调整的影响，每一工况运行结束后间隔72 h后开展下一工况试验。

1.3 活性污泥预处理及分析

1.3.1 活性污泥样品预处理

采集好氧池中泥水混合液装入已灭菌的离心管中，利用高速台式冷冻离心机以3 000 r/min离心15 min对活性污泥进行富集[8]，然后置于超低温冷冻储存箱-80 ℃冷冻24 h，进行高通量16S rRNA基因测序分析。

1.3.2 测序分析流程

首先利用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA，设计引物接头并利用聚合酶链式反应(PCR)扩增与产物纯化，对指定区域合成barcode特异引物。将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量工艺进行检测，利用Illumina技术进行16S rRNA测序分析。

2 结果与讨论

2.1 进水水质及污染物去除率分析

不同HRT工况下A2/O工艺平均进出水水质及污染物去除率见表2。

表2 不同HRT下平均进出水水质及污染物去除率

由表1可见，当HRT为26.25 h时，出水COD达到了《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918—2002)一级A标准(50 mg/L)[9]，此时COD去除率最高为85.90%，其余各工况出水均未达到GB 18918—2002一级B标准(60 mg/L)。TN在各HRT工况下均达到了GB 18918—2002一级A标准(15 mg/L)，但在HRT为21.00 h时TN去除率最高，达到73.68%。TP在各HRT工况下出水均满足一级B标准(1.5 mg/L)，其中在HRT为26.25 h时去除率最高(81.54%)。出水氨氮在4种HRT工况下均达到GB 18918—2002一级A标准(5 mg/L)，在HRT为15.00 h时去除率最高(93.17%)。综合上述分析可知，TN和氨氮出水水质均满足GB 18918—2002一级A标准，即表明HRT的长短对TN和氨氮的去除无明显影响；COD在HRT为26.25 h时去除效果最好，这与郝凯越等[10]研究一致。综合考虑氨氮虽在HRT为15.00 h时处理效果最好，但此时COD去除效果较差，而HRT为26.25 h时4种污染物均有较好的去除效果，故优先选择26.25 h为最佳的HRT运行工况，以便高效地去除污染物。HRT的变化会影响微生物群落多样性指数变化[11-12]和功能菌属丰度变化[13]，微生物群落的变化可以进一步导致出水水质发生变化。

2.2 A2/O工艺好氧池优势菌属功能分析

采用SPSS 22.0软件依据silva数据库对4个HRT工况下好氧池的污泥样本展开统计分析，利用核糖体数据库项目(RDP)分类和功能预测软件(PICRUSt)筛选出已知功能分类和代谢类型的前10种菌属，详细信息见表3。

由表3可见，腐螺旋菌属[14]、鞘脂菌属[15-16]和克里斯滕森菌科R-7群[17]为有机物降解菌；奥托氏菌属[18]、孤岛杆菌属[19]、norank_f_JG30-KF-CM45和贪食菌属[20]为反硝化菌；热单胞菌属[21]和产黄杆菌[22]为双重属性菌，既可以利用反硝化作用脱氮又可利用聚磷菌特有的聚磷功能除磷；戈登氏菌属为典型聚磷菌，在污水处理除磷功能中占据主导地位。综上可知，优势菌属主要代谢功能为有机物降解、反硝化脱氮和聚磷菌除磷。

表3 A2/O工艺好氧池前10种优势菌属功能分类

2.3 微生物群落代谢途径分析

2.3.1 A2/O活性污泥微生物群落主要代谢途径

为了进一步研究A2/O工艺中微生物群落各污染物代谢途径，通过与京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中基因功能比较，共获得239条代谢途径，筛选出丰度最大的前10条代谢途径并对代谢功能信息进行注释，不同HRT工况下各种代谢途径丰度值信息见表4。

表4 活性污泥微生物群落前10条代谢途径丰度

由表4可见，不同HRT工况下丰度最高的代谢功能为ABC转运蛋白(ko02010)，说明微生物细胞运输各类污染物、无机盐离子等物质较多，保证了各污染物代谢所需的营养条件；其次为细菌双组分调节功能(ko02020)，其主要作用为及时响应外界环境变化，做出利于自身生长的变化，在适应环境变化中有显著作用[23]，该代谢途径丰度仅次于ABC转运蛋白，显然在应对高原独特的环境中发挥着重要作用。嘌呤代谢(ko00230)、核糖体功能(ko03010)、嘧啶代谢(ko00240)等丰度也较高，均与污染物去除密切相关。此外，氧化磷酸化(ko00190)是磷代谢的主要途径；丁酸代谢(ko00650)和丙酮酸代谢(ko00620)是碳代谢的主要途径；精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)等是典型的氮代谢的主要途径之一。综上可知，高原生境下不同HRT工况的A2/O工艺中主要代谢途径为碳氮磷的代谢。代谢途径丰度的不同表明了微生物群落结构的不同，调节HRT导致了A2/O工艺中群落结构发生变化，不同群落结构组成导致了各污染物去除效果的好坏。从表4可以看出，HRT为26.25 h时各种代谢途径的丰度均最大，此时各种污染物代谢反应迅速，细胞新陈代谢活动最活跃，污染物处理效能最佳。

2.3.2 微生物群落碳代谢途径

分析活性污泥样品中的功能基因，发现5 582个功能基因参与各污染物的代谢途径，选取参与碳代谢途径的前10种功能基因并对其代谢途径进行分析，具体信息见表5。

由表5可见，碳代谢途径主要集中在脂肪酸代谢(ko00071)、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(ko00280)、脂肪酸生物合成(ko00061)、糖酵解/糖异生(ko00010)和丙酮酸代谢(ko00620)等途径[24]，脂肪酸、糖类和脂质代谢途径较多，与生活污水常见成分相关。本研究中试验用水碳氮比在8.30～11.62波动，确保了充足的碳源供应，因此碳代谢途径十分丰富。酶功能分类主要集中在脱氢酶、水合酶、还原酶、转移酶等。酶类分布以脱氢酶丰度最大，说明细胞代谢反应以氧化还原反应为主，主要消耗各类有机污染物，为细胞间的生命活动提供充足的碳源，也可高效去除污水中的有机物。其余酶类种类较多，表明微生物内部其他各类酶促反应较多，为微生物细胞的生命活动提供了生存环境和能源供应。

表5 碳代谢途径的前10种功能基因

2.3.3 微生物群落氮代谢途径

生活污水中氮素的含量较高，脱氮的过程一般为硝化反应、反硝化反应与氨化反应[25-27]，即主要通过硝化菌、反硝化菌(DNB)和氨氧化菌(AOB)将有机氮转变为氮气，这也是污水处理中主要的生物脱氮途径。选取参与氮代谢途径前10种功能基因并对其代谢途径进行分析，具体信息见表6。

由表6可见，氮代谢途径主要集中在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)、氮代谢(ko00910)和精氨酸和脯氨酸代谢(ko00330)等途径。与氮代谢相关的基因和酶参与氨基酸的合成分解代谢、硝化、反硝化和氨化反应一致，说明微生物细胞的氮代谢途径种类多且丰度较大，有利于以氨基酸为底物的生化反应的进行。另外，细菌双组分调节(ko02020)代谢途径的基因丰度最大，表明微生物细胞应对环境变化能力强。酶类分布以合成酶、脱氢酶和酸合酶为主，其中丰度最大的是合成酶，表明氮代谢途径主要以氨基酸代谢为主，通过合成氨基酸类物质，为构造大分子蛋白质提供物质基础，不断完善微生物脱氮系统的完整性从而消耗污水中的氮素。

表6 氮代谢途径的前10种功能基因

2.3.4 微生物群落磷代谢途径

生物除磷的主要途径是依靠聚磷菌聚磷，以此来消耗污水中的磷元素从而达到除磷的目的[28]。选取参与磷代谢途径前10种功能基因并对其代谢途径进行分析，具体信息见表7。

由表7可见，磷代谢主要途径是氧化磷酸化(ko00190)，参与磷代谢的基因都具备此项代谢途径。其中F型转运H+的ATP酶类数量和种类最多，表明转运ATP酶类数量多且对应基因丰度较大，其主要为细胞代谢和生命活动提供充足的能源支撑，从而使细胞利用氧化磷酸化途径来消耗污水中的磷。另外，氧化酶和脱氢酶数量也占据一定比例，在好氧条件下氧化磷酸化反应速度快，聚磷菌的微生物代谢较快，为除磷提供了有力的条件，导致除磷效果的提高。

表7 磷代谢途径的前10种功能基因

2.4 A2/O工艺微生物功能基因丰度分析

将污泥样品基因数据信息与KEGG数据库中已知基因数据进行比对，发现5 752个同源基因，选取不同HRT下活性污泥群落微生物细胞丰度排在前10的功能基因并对其名称和基因功能进行分析，具体信息见表8。

由表8可见，本研究丰度排名前10的功能基因中有7个与亚高原地区城市污水系统的功能基因相同[2]103，其中rpoE基因是革兰氏阳性调节基因，主要面对外界环境的变化作出反应，便于适应当前生存环境，且该基因丰度明显高于亚高原地区，推测因高原特殊生境造成该基因不断表达自身基因功能来适应高原特殊生境。ABC.CD.P、ABCB-BAC和ABC.CD.A属于转运系统蛋白基因，主要与各污染物的转化和分解有关。paaF和echA基因的产物是烯酰辅酶A水合酶，主要作用是参与氨基酸降解和碳固定等多种碳、氮代谢途径。fabG、OAR1基因的产物是3-氧代酰基-[酰基载体蛋白]还原酶，该酶主要参与碳代谢途径。drrA基因的产物是抗生素转运系统ATP结合蛋白，主要作用是减轻抗生素对细胞的毒性，使细胞群落适应在抗生素环境中生存。另外，高原生境下特有的功能基因号有：K02014(TC.FEV.OM)、K00626(ACAT、atoB)、K00257(mbtN、fadE14)。TC.FEV.OM基因的产物是铁复合物外膜受体蛋白，主要作用是污染物利用该受体蛋白进入细胞内完成污染物的降解。ACAT、atoB基因的产物是乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，该酶主要参与各种氨基酸代谢的氮代谢途径。mbtN、fadE14的产物是酰基ACP脱氢酶，主要参与氧化还原反应降解污染物。丰度前10的功能基因中仅有3个碳代谢优势基因存在，氮和磷代谢优势基因均不存在，即在基因水平仍以碳代谢途径为主。由以上分析可知，高原生境下A2/O工艺活性污泥微生物功能基因中以碳代谢途径的基因偏多，基因丰度相对最大，说明在各好氧池中有机物去除功能较完善。另外，不同HRT下功能基因丰度排序为26.25 h>17.50 h>15.00 h>21.00 h，表明HRT为26.25 h时活性污泥系统功能基因发生基因转录、翻译等过程最多，参与各种蛋白质表达和污染物代谢的功能越强大。因此，在基因水平上进一步说明26.25 h是最佳的HRT运行工况。

表8 不同HRT下活性污泥群落微生物细胞主要功能基因丰度

3 结 论

对高原生境下A2/O工艺污染物去除效果及好氧池中活性污泥优势菌功能、代谢途径和基因丰度进行分析，探讨不同HRT工况下A2/O工艺微生物代谢机制，结果表明：高原生境下，A2/O工艺HRT为26.25 h污水处理效果最好，微生物优势菌属代谢功能以有机物降解、反硝化脱氮和聚磷菌除磷为主，这与污水中常含此类污染物有关；微生物群落代谢途径分析可知，应对环境变化的细菌双组分调节(ko02020)丰度较大，该代谢途径在适应环境变化中有显著作用，并在HRT为26.25 h时达到最大值，是高原生境下的优势代谢途径；根据功能基因丰度分析，发现高原生境下活性污泥微生物细胞中rpoE基因丰度偏大，凸显高原生境对优势基因功能有一定的选择性， HRT为26.25 h时微生物中细胞功能基因丰度最大，即发生基因转录、翻译等过程最多，参与各种蛋白质表达和污染物代谢的功能越强大，进一步证实了优势菌属功能和代谢途径丰度最大的原因，与水质分析结果一致。因此，26.25 h是高原生境下A2/O工艺最佳的HRT运行工况。