肌钙蛋白I检测试剂质量性能的一致性评价

朱玉青 杨莎莎 栗晓冉 陈桂萍 万锡铭 河南省医疗器械检验所；国家药监局体外诊断试剂质量控制重点实验室 （河南 郑州 450018）

内容提要：目的：评价两厂家的荧光免疫层析法肌钙蛋白I（cTnI）检测试剂质量性能的一致性。方法：检测样本为企业参考品，采用Origin 2019软件对其质量控制的关键技术性能的一致性进行分析。结果：Kolmagorov-Smirnov检验分析显示，在0.05水平下，其最低检测限、重复性（25ng/mL）、批间差（25ng/mL）存在显著不同，其重复性（1ng/mL）、准确度、特异性、批间差（1ng/mL）不存在显著不同；函数拟合分析显示，其线性方程Spearman相关系数r=1，相关性高。结论：其最低检测限、重复性（25ng/mL）、批间差（25ng/mL）不一致；其重复性（1ng/mL）、准确度、特异性、批间差（1ng/mL）一致性良好，线性相关性良好；综合分析认为，其cTnI检测试剂的质量性能不一致。根据分析结果，提出以下建议：选择更合适的抗原抗体原材料、提高试剂生产工艺、应用新兴标记材料等新技术以提高不同厂家检测试剂的质量性能的一致性。

心肌肌钙蛋白I（cTnI）是心脏疾病标志物检测的金指标，比肌酸激酶同工酶等其他心脏标志物具有更高敏感性和特异性，被用于胸痛早期、急性心肌梗死、急性冠脉综合征（ACS）的快速诊断以及辅助ACS危险分层和预后等判断参考中[1-3]。荧光免疫层析技术作为一种POCT定量检测技术被越来越多地应用于疾病快速筛查和检测中。免疫层析法检测试剂（盒）技术审评规范（2017版）对cTnI定性免疫层析试剂的质量性能做了技术审评规范，但不同试剂厂家的原辅材料和生产工艺不完全相同，各企业参考品也不完全相同，那么不同厂家的试剂质量性能是否完全一致呢？基于此，本文对不同厂家的cTnI荧光免疫层析检测试剂的质量性能的一致性进行评价研究，具体是对控制试剂质量性能的几个关键技术指标进行Origin 2019软件分析和评价，并分析发生原因和提出合理化建议。

1.材料与方法

1.1 一般材料

检测样本：检测样本为企业参考品。厂家1共130例：最低检测限20例、重复性20例（其中1ng/mL、25ng/mL各10例）、准确度3例、线性18例、特异性9例、批间差60例（其中1ng/mL、25ng/mL各30例）；厂家2共75例：最低检测限20例、重复性16例（其中1ng/mL、25ng/mL各8例）、准确度3例、线性15例、特异性3例、批间差18例（包括1ng/mL、25ng/mL各9例）。

仪器设备：厂家1：自产Virion-1800荧光免疫分析仪，厂家2：自产干式荧光免疫分析仪。

检测试剂：厂家1的3批批号为20170001、20170002、20170003，厂家2的3批批号为201802001、201802002、201802003，于2017年11月开始，经历四个月左右的准备及实验，2018年3月进行结果分析，试剂质量性能符合2017版免疫层析法检测试剂技术审评规范、符合各自企业标准。

1.2 方法

方法学性能评价：通过对两厂家cTnI检测试剂质量性能的关键技术指标的检测对比，对其一致性进行评价研究。

1.3 统计学分析

采用Origin 2019软件对两厂家cTnI检测试剂的最低检测限、重复性、准确度、特异性、线性和相关性、批间差等技术指标进行对比分析，采用Pearson相关系数r进行相关性分析，P＜0.05表示具有统计学意义。

2.结果

2.1 最低检测限、重复性（1ng/mL和25ng/mL）和准确度

最低检测限、重复性（1ng/mL和25ng/mL）和准确度的平均值、标准差、检测样本个数及各样本间的关系通过Origin 2019统计分析显示见图1。采用Kolmagorov-Smirnov检验分析结果显示，对于最低检测限，P＜0.05，两者最低检测限显著不同，厂家1明显大于厂家2；对于重复性（1ng/mL），P＞0.05，两者不存在显著不同；对于重复性（25ng/mL）P＜0.05，两者显著不同，厂家1明显小于厂家2；对于准确度，用回收率（R）表示，检测样本厂家1稀释方案：高浓度cTnI：低浓度cTnI（40:0.15=1:9），厂家2稀释方案：高浓度cTnI：低浓度cTnI（50:0.2=1:9），分析显示P＞0.05，两者准确度不存在显著不同。

图1.两厂家的最低检测限、重复性、准确度检测结果（注：1a.最低检测限；1b.重复性；1c.准确度检测结果）

2.2 线性和相关性、特异性检测

线性和相关性检测中，厂家1有6个检测样本：50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、2ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL；厂家2有5个检测样本：50ng/mL、25ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.2ng/mL；其中每个样本做3个重复，取平均值进行函数拟合。Origin 2019 Spearman相关性分析和和双尾显著检验相关性分析结果（图2a）显示，Spearman相关系数r=1，两者相关性高。

图2.两厂家检测样本的函数拟合、特异性检测结果（注：2a.函数拟合检测结果；2b.特异性检测结果）

特异性检测中，其检测样本、及各样本间的数值关系通过Origin 2019散点统计图进行分析（图2b），Kolmagorov-Smirnov检验分析结果显示，P＞0.05，两者特异性不存在显著不同。

2.3 批间差（1ng/mL和25ng/mL）检测

批间差（1ng/mL和25ng/mL）检测中，其平均值、标准差、检测样本个数及各样本间的数值关系通过Origin 2019统计分析显示如下（图3）。Kolmagorov-Smirnov检验分析结果显示，对于批间差（1ng/mL），P＞0.05，两者不存在显著不同；对于批间差（25ng/mL），P＜0.05，两者显著不同，厂家1明显小于厂家2。

图3.两厂家的1ng/mL和25ng/mL检测样品批间差检测结果（3a.1ng/mL检测样品；3b.25ng/mL检测样品）

3.讨论

从以上结果可知，对于试剂的质量性能指标，两厂家的最低检测限、重复性（25ng/mL）、批间差（25ng/mL）不一致，重复性（1ng/mL）、准确度、特异性、批间差（1ng/mL）、线性一致性好，且两者线性相关性良好。本研究综合分析认为，两厂家cTnI检测试剂的质量性能不一致。

结合这些结果，对cTnI检测试剂的质量性能及其一致性进行进一步分析探讨。两厂家最低检测限不一致，原因可能为：不同试剂厂家使用的抗体原材料不同；不同心脏病类型中的cTnI半衰期不同。对于第一种原因，不同厂家可以选择能够识别抗体高稳定性cTnI抗原中央区（30-100氨基酸序列）的抗体作为原材料来实现该项指标的一致和标准化；对于第二种原因，因cTnI在循环系统中通常是以二元或者三元复合物形式存在，恰当使用EDTA等Ca2+离子螯合剂可使复合物降解，从而使检测结果保持一致。两厂家的重复性（1ng/mL）一致性好，重复性（25ng/mL）不一致，这项指标的优劣在一定程度上反映试剂生产工艺的优劣，可通过改善生产工艺提高试剂质量。两厂家准确度评价一致性良好，主要是考察检测值趋近于真实值的程度，通常用回收率实验进行检测，本研究中两厂家采用的均是稀释回收率实验。准确度的影响因素有血清基质的非特异性影响，实验中应尽量减少如溶血、高胆红素血症、风湿因子等的影响，并选择已纯化、性能稳定、浓度已知的高浓度抗原按一定比例稀释成系列溶液，至少配制3个不同浓度添加到空白中，每个浓度参考品配制2份[2]。两厂家特异性检验一致性良好，本研究采用的是实际测量值方法，即对cTnI的结构类似物：含1000ng/L的cTnC、含1000ng/L的cTnT、含1000ng/L的sTnI的样品分别进行实际值测量。资料显示，自身抗体和类风湿因子等会对试剂特异性产生影响，将捕获抗体的抗原表位选择在氨基酸N-末端和C-末端可以减少自身抗体对cTnI试剂特异性的影响[5]。另外，由于荧光标记免疫分析技术方法本身的局限性和特点，试剂的最低检测限和特异性是一对相关联的技术指标，因此试剂在研发生产中应根据不同的临床标志物、特异性和灵敏度的实际情况需要进行抗体原材料的筛选[6]。对于批间差检测，是一种分析间精密度检测。本研究中该项指标是在同一试剂不同批次间进行的检测，标准要求其变异系数（CV）或者相对极差（R）不大于15%。Origin 2019分析结果显示，两厂家批间差（1ng/mL）一致性良好，批间差（25ng/mL）不一致。

基于以上分析，特提出一些建议，以更好地发挥cTnI试剂在心血管疾病早期诊断、危险分层、预后、治疗中的作用：①生产厂家需要进一步提高cTnI试剂质量。改进措施可以有：选择优质良好的抗原、抗体原材料，如捕获抗体可选择具有C端和N端抗原表位的抗体片段或者能够识别高稳定性cTnI中央区（30-100氨基酸序列）的抗体，这有助于改善各厂家cTnI试剂的最低检测限和特异性的一致性；提高固化生产工艺有利于改善试剂的重复性、批间差；新兴纳米材料和生物传感器的使用有助于生产出超灵敏、背景更小的试剂；上转换发光、“无标记”等技术的使用有助于生产出更优质的定量检测试剂；血清盘结合生物标记算法建立的统一校正标准品有助于生产出更优质、一致性更好的检测试剂[7]。②试剂上市前增加对临床样本的检测以对试剂质量性能进行进一步验证评估。③避免临床中对疾病本身无关、不必要、不合理的检测以及对检测结果的误判和不正确的分析解释等，避免在健康女性、婴儿和新生儿体检中cTnI升高误判现象的发生，减少血清基质中非特异性物质（溶血、高胆红素血症、风湿因子等）的影响，应结合患者心电图等检测指标和临床症状对cTnI升高患者进行综合判断和正确解释[7]。④选择心脏标志物联检（如cTnI、NT-proBNP和D-Dimer联检或者cTnI、Myo和CK-MB联检）和与之相适应的其他POCT检测方法。