不同硒源及浓度对偏关苜蓿种子萌发及物质转化的影响

张士敏， 朱慧森， 赵娇阳， 卫 凯， 夏方山

(山西农业大学草业学院， 山西 太谷 030801)

硒是人和动物的必需元素。主要以硒蛋白的形式参与各项生命活动，起到抗氧化和提升机体免疫水平等作用[1-3]。同时，适宜的硒浓度可通过增强植物的抗氧化能力来促进植物的生长，因此，硒被认为是植物的准必需微量营养素或有益营养素[4]，在富硒土壤中生长的植物如黄芪(Astragalusbisulcatus；豆科)、赤柱花(Stanleyapinnata；十字花科)等，可以将硒积累到高达 10 000 mg·kg-1DW的浓度，且主要以有机硒的形式进行存储，可作为人和动物的重要补硒载体[5-6]。然而，我国三分之二地区属缺硒地区，其中黄土高原中北部是典型的缺硒区，土壤硒含量低于 0.1 μg·g-1，而土壤缺硒会对饲草及粮食作物的生产造成不利影响，甚至威胁人和动物的健康[7-9]，因此，如何科学的进行动植物补硒成为一个亟待解决的问题。由于目前补硒试剂大多为无机硒化物或人工合成有机硒，直接添加到食品或饲料中存在较大的安全隐患，且容易受到加工工艺、生产成本等各种因素的影响，质量难以保证[10]。因而将硒转移到牲畜和人类食物链的一个更为安全有效的方式是向饲草、作物及蔬菜施加外源硒，以提高食物链的硒水平，进而提升补硒效率[11]。

近年来，多位学者已针对粮食作物小麦[11](TriticumaestivumL.)、豌豆[12](PisumsativumL.)、水稻[13](OryzasativaL.)及蔬菜[14]等开展硒的生物强化研究。对饲草富硒研究表明，紫花苜蓿(MedicagosativaL.)对硒有超强的吸收和富集能力，是将无机硒转化为有机硒的重要载体，可通过食物链对动物和人体进行安全、高效补硒[15-16]。

在植物中，低浓度的硒经常被报道对植物的生长和发育有利。如低浓度(<15 μmol·L-1亚硒酸盐和硒酸盐)施硒对生菜[17](LactucasativaL.)、(≤14 mg·L-1)白芥菜(BrassicajunceaL.)、(<107 mg·L-1)油菜[18](BrassicacampestrisL.)和(15～60 μmol·L-1亚硒酸盐)大米[19-20]等作物种子萌发和营养品质均有显著的促进作用。但高浓度的硒却可通过降低碳水化合物水解相关酶的活性干扰种子的萌发，并可导致胚的死亡[19]。目前，关于硒对紫花苜蓿种子萌发的研究，多以无机硒为硒源[21-23]，关于有机硒对紫花苜蓿种子的萌发研究较少，主要集中在蛋氨酸硒对豇豆[24](VignasinensisL.)、南瓜[25](Cucurbitamoschata(Duch.ex Lam.)Duch.ex Poiret)、厚皮甜瓜[26](Cucumismelo)等生长发育的影响。本研究通过比较两种硒源对苜蓿种子发芽阶段形态变化及物质转化影响的差异性，确定苜蓿种子萌发过程中亚硒酸钠、蛋氨酸硒作为外源浸种剂的最佳浓度，为硒对紫花苜蓿的营养代谢及促生作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验所用紫花苜蓿为地方培育品种‘偏关’苜蓿(Medicagosativa‘Pianguan’)，由山西农业大学草业学院种质资源库提供。

硒肥：无机硒为亚硒酸钠(Na2SeO3,AR),含硒量45.01%，购于成都化夏化学试剂有限公司；有机硒为蛋氨酸硒(C5H11NO2Se，AR)，含硒量0.2%，购于成都施普诺科技有限公司。

1.2 培养条件

试验于2020年6月在山西农业大学草学实验室进行。试验选取饱满均匀的苜蓿种子于1.0% NaClO溶液中消毒5 min，蒸馏水冲洗3～4次，吸水纸吸干，置于垫有两层滤纸的直径9 cm的培养皿中，每皿100粒种子，4个重复，每个培养皿中加5 mL硒溶液，对照(CK)加5 mL蒸馏水。亚硒酸钠浓度设定为0.3，0.6，1.2，2.4，4.8，9.6 mg·L-1，蛋氨酸硒浓度设定为1，5，10，20，40 mg·L-1，采用Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6及D1，D2，D3，D4，D5来表示，所对应的纯硒浓度分别为0.14，0.27，0.54，1.08，2.16，4.32 mg·L-1和0.40，2.01，4.03，8.06，16.12 mg·L-1。将培养皿置于人工气候培养箱中，光强5 000 lx，光周期为12 h/12 h，温度20℃恒温，相对湿度80%进行发芽。为保证硒溶液浓度稳定，采用称重法每天补充适量蒸馏水。

每24 h记录种子发芽情况(以胚根伸出种皮作为发芽标准)，于处理第4 d时统计种子的发芽势，第10 d时统计种子的发芽率，测量苜蓿幼苗的胚芽长、胚根长、胚根直径(胚根基部直径最大处)、单株鲜重，计算发芽指数、活力指数、干重占比，并测定幼苗的还原糖、总氨基酸含量及硝酸还原酶(Nitrate reductase,NR)活性。

1.3 测定方法

种子发芽势、发芽率采用常规统计方法测定：发芽势(%)=(4 d内正常发芽种子数/供试种子数)×100，发芽率(%)=(10 d内正常发芽种子数/供试种子数)×100。胚芽长、胚根长及胚根直径的测定：发芽第10 d时，每处理随机选取20株幼苗，采用精度为0.01 mm的游标卡尺分别测量胚芽长、胚根长、胚根直径，求平均值。幼苗单株鲜重的测定：发芽第10 d时，每处理随机选取40株幼苗，用吸水纸擦干后，称量其鲜重，求平均值。幼苗干重占比：在每个重复取样完成后，将剩余的幼苗用吸水纸擦干称量鲜重，然后在105℃杀青10 min，65℃下烘至恒重，称其干重，并计算干重占比。发芽指数(GI)= ∑(Gt/Dt)，活力指数(VI)=GI×S。其中，Gt为在t日的发芽种子数，Dt为发芽天数，S为单株鲜重。

还原糖含量采用3，5-二硝基水杨酸法测定[27]，总氨基酸采用茚三酮比色法测定[28]，硝酸还原酶(NR)测定参考高俊凤等[29]的方法，以上各指标重复3次。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Excel整理数据，SAS 9.2软件进行方差分析及相关性分析，用Duncan法进行多重比较，差异显著性定义为(P<0.05，结果采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发的影响

施硒可影响紫花苜蓿种子的发芽，如图1所示，本试验所用两种硒源对种子发芽参数的影响趋势基本一致，均为先促进后抑制，即有明显的浓度效应。在0.6 mg·L-1亚硒酸钠浓度下，苜蓿种子发芽势、发芽率及发芽指数相比CK分别增加了4.40%，3.25%，5.83%；但当亚硒酸钠浓度为4.8 mg·L-1时，苜蓿种子发芽率已显著下降(P<0.05)，当浓度达到9.6 mg·L-1时，其活力指数则显著下降(P<0.05)，降幅分别为4.79%，20.87%。由图1B和1C可知，苜蓿种子在1 mg·L-1蛋氨酸硒处理下，发芽率相比CK增幅为2.29%，而用5 mg·L-1蛋氨酸硒处理时，其活力指数相比CK有10.13%的增幅。但苜蓿种子除发芽势在40 mg·L-1蛋氨酸硒处理下显著下降外，其余发芽指标均在20 mg·L-1蛋氨酸硒处理时已开始显著下降(P<0.05)。

图1 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发的影响Fig.1 Effects of different selenium sources and concentrations on seed germination of alfalfa注：相同硒源处理，不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，下同Note:In the same selenium sources，different capital letters indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

2.2 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发后表型变化的影响

不同硒源及浓度对苜蓿种子形态变化影响的趋势不同，由图2B可知，0.3 mg·L-1亚硒酸钠及1 mg·L-1蛋氨酸硒处理下可显著提高苜蓿幼苗的胚根长(P<0.05)，增幅分别为19.63%及19.04%；而当亚硒酸钠及蛋氨酸硒浓度分别达到9.6，20 mg·L-1时，胚根的伸长被显著抑制(P<0.05)；由图2A，2C，2D，2E可知，苜蓿幼苗的胚芽长、单株鲜重、胚根直径及干重占比，均在0.3 mg·L-1亚硒酸钠浓度下达到最大值，但各指标在不同硒浓度处理下差异均不显著。1，5 mg·L-1蛋氨酸硒处理均可显著提高苜蓿幼苗的胚根直径(P<0.05)，增幅分别为35.57%，40.11%。当蛋氨酸硒浓度达到40 mg·L-1时，苜蓿幼苗的单株鲜重显著降低(P<0.05)。

图2 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发后表型变化的影响Fig.2 Effects of different selenium sources and concentrations on phenotypic changes of alfalfa seeds germination

2.3 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发后还原糖积累及氮转化的影响

施硒对苜蓿幼苗生理指标的影响如图3所示，由图3A可知，在0.3，0.6 mg·L-1亚硒酸钠处理下，苜蓿幼苗还原糖含量均显著提高，增幅分别为10.83%和14.45%，而采用5，10 mg·L-1蛋氨酸硒处理时，苜蓿幼苗的还原糖含量相比CK也显著提高(P<0.05)；由图3B可知，除4.8 mg·L-1亚硒酸钠处理外，各浓度均可显著提高苜蓿幼苗的硝酸还原酶活性(P<0.05)，而采用1，5，10 mg·L-1蛋氨酸硒处理时，苜蓿幼苗的硝酸还原酶活性也显著提高(P<0.05)，增幅分别为152.72%，76.70%，81.76%。但无论是还原糖含量和硝酸还原酶活性均随硒浓度的升高呈现先升后降的总体变化趋势。由图3C可知，在0.3 mg·L-1亚硒酸钠处理下，苜蓿幼苗总氨基酸含量显著提高(P<0.05)，增幅可达20.66%，而40 mg·L-1蛋氨酸硒处理下，苜蓿幼苗的总氨基酸含量也显著提高(P<0.05)。

图3 不同硒源及浓度对紫花苜蓿幼苗还原糖积累及氮转化的影响Fig.3 Effects of different selenium sources and concentrations on reducing sugar accumulation and nitrogen transformation of alfalfa

2.4 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子发芽阶段影响的综合比较及相关性分析

在适宜硒浓度下，两种硒源对苜蓿种子萌发及幼苗生长均能产生促进作用(表1)。在蛋氨酸硒浓度为D2时可显著提高苜蓿幼苗的胚根直径(P<0.05)。在Y1和D2硒浓度处理下，苜蓿幼苗总氨基酸含量显著提高(P<0.05)。施硒对苜蓿幼苗生长及生理指标的影响要大于种子萌发指标。在Y2亚硒酸钠浓度处理下，苜蓿幼苗还原糖含量相比CK显著提高(P<0.05)；Y1和D1硒浓度处理下，苜蓿幼苗的胚根长和硝酸还原酶活性相比CK显著提高(P<0.05)，且D1相比Y1硒浓度处理仍能显著提高苜蓿幼苗的硝酸还原酶活性(P<0.05)。

施硒与紫花苜蓿种子发芽参数的相关性分析(表1)表明：硒浓度与苜蓿种子的发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数呈极显著负相关(P<0.01)。硒源与发芽指数呈极显著负相关(P<0.01)，与活力指数呈显著负相关(P<0.05)。硒源×硒浓度与发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数均有显著的交互作用。硒浓度与胚根长、单株鲜重呈极显著负相关(P<0.01)。硒源与胚根直径呈显著正相关(P<0.05)。硒源×硒浓度与苜蓿幼苗生长指标胚芽长有显著的交互作用(P<0.05)，与胚根长有极显著的交互作用(P<0.01)。硒浓度与硝酸还原酶活性呈显著负相关(P<0.05)，与总氨基酸含量呈极显著的正相关(P<0.01)。硒源与硝酸还原酶活性及总氨基酸含量呈显著正相关(P<0.05)。硒源×硒浓度与苜蓿幼苗硝酸还原酶活性有显著交互作用(P<0.05)，与还原糖及总氨基酸含量有极显著的交互作用(P<0.01)。

表1 不同硒源及浓度下紫花苜蓿种子发芽参数综合比较及相关性分析Table 1 Comprehensive comparison and correlation analysis of germination parameters in alfalfa treated by different selenium sources and concentration

3 讨论

3.1 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发的影响

发芽率与发芽势是反映种子萌发特性的重要指标，发芽势是种子生活力和幼苗整齐度的体现，发芽率是指活种子占供试种子的比例，能够反映种子的出苗情况。发芽指数反映了种子的发芽速率和整齐程度，而活力指数反映了种子在各种生境条件下迅速发芽和生长的整齐度的能力[30]。研究发现，适宜的亚硒酸钠浓度(2，4，6 μmol·L-1；15～60 μmol·L-1)可提高芥菜发芽率[31]，并有利于水稻出苗和幼苗生长[19]。本试验中，0.3，0.6 mg·L-1亚硒酸钠处理，有提高苜蓿种子的发芽势与发芽率的趋势，而蛋氨酸硒只在浓度为10 mg·L-1时，有提高苜蓿种子发芽势的趋势，表明适宜的亚硒酸钠浓度在种子萌发阶段更能促进种子内部的物质转化，从而加速形态转化，即提高种子发芽率。适宜的亚硒酸钠浓度(0.3，0.6 mg·L-1)可提高苜蓿种子的发芽指数，表明亚硒酸钠能够改善苜蓿种子的发芽质量，彭琪等通过硒对苜蓿种子萌发试验的研究，也得出与此一致的结论[21]。蛋氨酸硒在最适浓度5 mg·L-1时，依然没能显著促进苜蓿种子的发芽指数，这与其对苜蓿种子发芽势及发芽率影响不显著有关。另外，随着亚硒酸钠及蛋氨酸硒浓度的增加，苜蓿种子的发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数都呈下降趋势，表明苜蓿种子的萌发对硒的响应存在浓度效应，即苜蓿种子萌发指标与硒浓度呈显著的负相关性。虽然蛋氨酸硒对苜蓿种子萌发指标的促进作用要弱于亚硒酸钠，但此阶段苜蓿种子对其耐性更强，适宜的硒浓度范围更广，说明苜蓿种子对无机硒更敏感，而对有机硒则表现出一定的耐受性。

3.2 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发后表型变化的影响

研究表明，低剂量的硒肥可促进种子萌发后幼苗的生长，以获得更健康的植株，增加作物产量，改善营养品质[32]。种子萌发时，胚根一般先突破种皮伸出种子之外，而根系作为植物体生长最活跃的吸收器官和合成器官，可直接反映发芽种子内部的物质转化速率，且其发育水平可直接影响地上部的生长和健康状况。在幼苗生长过程中，胚芽长、胚根长、胚根直径、幼苗单株鲜重及干重占比是反映幼苗生长状况的关键指标。据报道，施用亚硒酸钠可将芥菜种子萌发过程中根长及地上部长度分别提高88.3%和18.2%[31]。本试验中，在0.3，0.6 mg·L-1亚硒酸钠在处理下，苜蓿幼苗的胚根长有增加的趋势，而在亚硒酸钠浓度为0.3，0.6及1.2 mg·L-1时，其单株鲜重均有增加的趋势，但仅在最低浓度0.3 mg·L-1时，提高了胚根长，表明以上指标对亚硒酸钠浓度的敏感性排序为胚根长>胚芽长>单株鲜重。与CK相比亚硒酸钠各浓度均不能显著提高苜蓿幼苗的胚根直径与干重占比，表明其对胚根发育及幼苗干物质积累的促进作用有限。5，10 mg·L-1蛋氨酸硒有促进苜蓿种子胚芽长的趋势，1，5 mg·L-1蛋氨酸硒处理下胚根直径显著增大，单株鲜重也有增加的趋势。但仅在1 mg·L-1蛋氨酸硒处理下，可显著促进其胚根长的发育，由此表明上述指标对蛋氨酸硒浓度的敏感性排序为胚根长>单株鲜重>胚芽长>胚根直径，与CK相比蛋氨酸硒各浓度同样没能显著促进苜蓿幼苗干物质的积累，但综合以上分析表明，适宜浓度下，蛋氨酸硒相比亚硒酸钠更能促进苜蓿幼苗胚芽及胚根的发育，从而提高苜蓿幼苗的单株鲜重，为苜蓿苗期的生长发育奠定基础。

3.3 不同硒源及浓度对紫花苜蓿种子萌发后还原糖积累及氮转化的影响

硒可通过提高碳水化合物代谢的能力来促进植物的生长[33]，主要表现在硒可诱导淀粉酶活性的增加，从而将淀粉水解成单糖等可溶性糖[34]，而可溶性糖的积累在维持渗透平衡方面起重要作用，因为还原糖多为可溶性糖，所以还原糖含量的增加，可通过调控苜蓿幼苗机体的渗透平衡，而提高其抗逆性[36-37]。本试验中在亚硒酸钠浓度为0.3，0.6 mg·L-1及蛋氨酸硒浓度为5，10 mg·L-1时，均可显著促进苜蓿幼苗还原糖的积累，表明苜蓿幼苗还原糖的积累可适应较大的硒浓度范围，尤其能适应较高浓度的蛋氨酸硒。Khaliq等[19]通过对芥菜种子施硒，发现其幼苗还原糖、总糖含量显著提高，与本研究结果一致。NR是一种氧化还原酶，可使硝酸盐转换成亚硝酸盐，然后在亚硝酸盐还原酶的作用下转化为铵，最后用于蛋白质的合成。因此，NR在氮代谢，尤其是蛋白质的合成过程中，发挥着重要作用。另外，糖积累(特别是蔗糖和葡萄糖)可通过控制蛋白质周转和由特定蛋白介导的磷酸化状态来影响NR的实际酶活，在NR的活性调节中起主要作用[38]。由此可推测，施硒通过促进糖的积累而影响NR的活性，进而调节氮代谢。研究发现，适量施用蛋氨酸硒可显著提高厚皮甜瓜果肉硝酸还原酶活性[24]、可溶性糖及游离氨基酸含量[39]，也再次印证了本试验的研究结果。同时，施硒可显著提高芥菜幼苗蛋白质、氨基酸和氮的含量[19]，而硫代谢对氮代谢有直接影响，因此可初步推断，施硒通过调控硫代谢而对氨基酸和蛋白质的生物合成产生影响[40]。

本试验中，亚硒酸钠各浓度及蛋氨酸硒在1，5，10 mg·L-1浓度下，均能提高NR的活性，而9.6 mg·L-1的亚硒酸钠与10 mg·L-1的蛋氨酸硒所对应的纯硒含量接近，说明苜蓿幼苗的NR活性对两种硒源的耐受浓度相近，且1，5，10 mg·L-1蛋氨酸硒可同时促进还原糖积累及NR的酶活性。虽然亚硒酸钠各浓度所对应的两者曲线关系相比蛋氨酸硒吻合度稍差，但仍有较高的相关性，因此本试验也验证了还原糖积累与NR酶活的高度相关性。同时，苜蓿幼苗总氨基酸的积累与NR酶活的变化趋势也基本一致，尤其是蛋氨酸硒浓度变化所诱导的NR酶活性与总氨基酸积累量相一致。40 mg·L-1蛋氨酸硒所对应的总氨基酸含量异常升高，推测可能是由于较高的蛋氨酸硒浓度使苜蓿幼苗氮代谢失衡，导致大量的功能蛋白质分解为氨基酸，使得氨基酸总量异常升高，抑制了幼苗的生长。

4 结论

综上所述，亚硒酸钠促进苜蓿种子萌发的效果要优于蛋氨酸硒，但其有益范围较窄，浓度超过1.2 mg·L-1就会对种子萌发产生抑制作用，而蛋氨酸硒浓度在10 mg·L-1时，对苜蓿种子的发芽势和发芽率仍有一定的促进作用，其中发芽指数和活力指数以5 mg·L-1蛋氨酸硒处理效果最佳。蛋氨酸硒对苜蓿幼苗生长的促进作用要优于亚硒酸钠，尤以5 mg·L-1蛋氨酸硒处理下苜蓿幼苗的胚芽长、单株鲜重及胚根直径效果最佳，且胚根直径显著大于对照和亚硒酸钠处理组。施硒通过对胚根发育的促进作用，也间接提高了苜蓿幼苗地上部的生长。适量的硒浓度还可促进还原糖的积累，而还原糖含量的提高又可激活硝酸还原酶，进而影响氮代谢，但各生理指标对亚硒酸钠浓度的变化也较为敏感，稍高的浓度就会引起剧烈的生理变化及物质转化，而5 mg·L-1蛋氨酸硒可显著提高苜蓿幼苗还原糖含量及硝酸还原酶活性，进而增加总氨基酸含量，因此苜蓿种子发芽阶段使用5 mg·L-1蛋氨酸硒作为促生长剂进行硒生物强化效果最为理想。