农产品因辐照灭菌效果快速测试中对于ATP生物发光技术的应用

李奎 蔚江涛 牛伟 白俊青 李世超

（1.杨凌核盛辐照技术有限公司 陕西西安 710100；2.中陕核核盛科技有限公司 陕西西安 710100）

我国农产品辐照研究工作与辐照灭菌技术的应用开始于20 世纪50 年代末，经过半个多世纪的发展，国内农产品的辐照设备、辐照技术、辐照应用范围相对扩大。尤其在网络购物方式兴起后刺激了农产品需求、提升了消费者对农产品的品质要求。在这种情况下，需要进一步增强农产品辐照灭菌效果快速测试，实现对其危害与关键点的控制。下面先对ATP生物发光技术作出说明，再对其应用展开分析。

1 ATP生物发光技术

ATP中文名为腺苷三磷酸，分子简式为A-P～P～P，主要由腺嘌呤、核糖、磷酸基团（3 个）共同构成，作为一种高能磷酸化合物发挥作用。ATP的生成途径包括光反应、细胞呼吸等。在细菌中ATP 含量与细菌量呈正相关关系，细菌死亡后ATP 会迅速发生酶降解现象或者扩散现象。当细菌量增大量，细菌内的ATP 含量相对增大，反之则减小。细菌在辐照死亡后，ATP会扩散出去。因此，在该特征下，结合生物发光（主要是生命活性生物体产生的化学发光现象，如萤火虫等）逐渐形成了可资利用的ATP 生物发光技术。简单讲，就是通过化学发光现象，对ATP进行测定，以此确定测定对象中的细菌量［1］。

例如，在常见的农产品脱水蔬菜中，大肠杆菌十分常见。按照我国企业产品质量卫生标准规范看，脱水蔬菜中菌落总数需要控制在每克不大于10000 个，其中的大肠杆菌MPN 应控制在30 个/100g 的范围内［2］。根据现阶段的研究成果看，普通细菌中应用的辐照剂量往往高于大肠杆菌死亡所需的辐照剂量，因此，在这种情况下，可以针对脱水蔬菜中的细菌ATP，采用ATP生物发光技术进行处理，提高辐照灭菌效果与测试速度。从实践经验看，从2005 年开始，我国在各级卫生监督机构中已经配置了ATP 发光检测设备，目前对其应用效率与效用均有所提升。

2 ATP生物发光技术的具体应用分析

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

以某食品企业生产制造的调味品为准，本次研究中选择的供试材料包括辣椒粉、胡椒粉、脱水蔬菜。试剂以采购方式为准，购于中国科学院某植物生理研究所，具体的试剂包括ATP标样、荧光素、荧光素酶。

2.1.2 辐照处理

首先，将剂量率设置为50Gy/min。其次，在该标准下设置不同剂量，本次研究中设置的剂量共计5个，分别为0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy，按照每个剂量处理3次的方式进行操作。

2.1.3 ATP提取步骤

第一，分别称取0.5g 辣椒粉、胡椒粉、脱水蔬菜样品，按照1∶10（m/v）、1∶10（m/v）、1∶20（m/v）的比例混入Tris-EDTA 进行混合，制成浆液。本次实验中选择的Tris-EDTA 中，Tris 为20mmol/L、EDTA 为2mmol/L，酸碱度为7.75。第二，在沸水浴中，设置90s煮混合浆液，待其煮沸后即刻进行冷却处理。第三，在离心机中按照3000r/min的速度对其进行离心处理，共计3min。第四，将离心后的混合浆液中的上清液取出用于ATP 待测液。需要说明的是在ATP 发光强度方面，细菌ATP大于非细菌，因此可以活力非细菌ATP清除步骤。

2.1.4 ATP测定步骤

首先，取ATP 待测液200ul 放入反应杯，然后将反应杯放入SHG-D生物化学发光仪中。其次，取荧光素酶-荧光素混合液800μL 注入反应杯，盖好盖子后，将发光仪上的温度设置为25℃、时间设置为10s，测定ATP 溶液发光值。在发光强度表示方面，严格按照相对发光单位RLU，将积分值设置在10s以内。

2.2 结果与分析

2.2.1 待辐照农产品含菌量测定

首先，对待辐照农产品样品中的非细菌ATP 发光强度与ATP发光强度进行比较分析，前者小于后者，节省了对非细菌ATP 清除环节。同时，细菌ATP 提取时间共花去90s，其中存在最大发光强度。另外，在回收率方面进行总结，3种样品的回收率均在95%以上，试验时间范围在1～2h。因此，满足常规ATP 提取要求。其次，将试验材料分为6份，每个样品均为2份：1份进行高压灭菌、1份不灭菌。将2份样品混合后配置含菌样品，测定细菌ATP生物发光与细菌总数，建立坐标系获得3种样品的回归方程：（1）Y辣椒粉=0.1953X+2.1962；（2）Y胡椒粉=0.3202X+2.4468；（3）Y香葱粉=1.4367X-3.2850。统计分析结果显示，r值分别为0.99、0.98、0.98，均大于0.96（r0.01值）。由此可知，细菌总数与细菌ATP 发光强度之间存在相关性。由于溶液颜色对于ATP发光强度的影响表现为“色素浓度增大，影响随之增大”，由此也导致了回归方程对应曲线斜率方面的差异。

2.2.2 辐照农产品含菌量测定

第一，在0kGy、3.0kGy、6.0kGy、9.0kGy、12.0kGy 剂量下，对辐照样品进行ATP发光强度数据统计，结果显示，在不同的剂量下，辐照样品中细菌ATP提取液发光强度随着剂量的增大而增加，发光强度呈现为先高后低的趋势，详见表1。根据ATP 生物发光技术的基本应用原理看，辐照后的农产品中的活菌数是先增后减，结合实践经验看，在压力蒸汽灭菌条件下，农产品含菌量与细菌ATP发光强度之间存在一定的线性关联。在辐照条件下，ATP 二者具有相关性。区别仅在于辐照灭菌处理条件下，会对样品检测过程产生相应的影响，而且这种影响可以持续50d 左右，时效性相对较好［3］。

表1 不同辐照剂量下的脱水蔬菜发光强度与细菌总数

第二，从动力学角度分析细菌ATP生物发光过程，发现将荧光素酶-荧光素加入到细菌ATP 提取液后不久（较短时间内），ATP发光值达到最高点，满足动力学方程。具体分析中主要是采用直线化处理办法，将动力学方程处理为直线方程，然后对其发光曲线动态变化情况进行测定分析，进而反映出发光过程受到的影响程度。操作如下：（1）对A=A0e-Kt（k 为常数）进行直线化处理，得 到InA=InA0-kt。（2）假定Y=InA，Y0=InA0，得到Y=Y0-kt。（3）假定测量时间间隔为4s，可以对其进行连续性测定，详见表2。结果显示处理后的样品内细菌ATP发光强度衰减速度快。既符合ATP生物发光技术的原理，也与本次实验测定结果趋于一致。根据数值统计结果看，当辐照剂量为5.0kGy 时达到了最大值，之后处于降低趋势。

表2 农产品辐照条件下对细菌ATP 生物发光影响

第三，辐照处理产生的影响情况看，在应用ATP生物发光技术时主要是依赖于添加的荧光素酶-荧光素。从特征看，该物质具有较高的特异性与灵敏度，当其加入到ATP 提取液之后，ATP 的浓度也随发光强度的变化而变化［4］。由于本次研究中采用的辐照以γ射线为主，所以在辐照条件下对其发光强度变化与ATP 浓度之间的关系可以通过γ射线做进一步分析。用紫外分光光度计对样品中ATP 含量检测时，当紫外线波长为260nm，ATP 在吸收紫外线方面对其具有较好的吸收性，同时当吸光值增大时，也表明其中的ATP 含量较大，由此可知其中的含菌量较大。反之，当吸光值变小时，则会出现活菌量较小的现象。因此从关系方面看，紫外线与样品ATP含量呈现为负相关关联。在电离辐射时选择γ射线，统计相关数据结果显示剂量增大时，其中的ATP含量因吸收了γ射线而相应减少。因此在辐照条件下，ATP含量不会增大，反而会因辐照时间的延长、辐照被吸收量的增大而减少。

第四，从干扰方面分析，待辐照样品含菌在辐照条件下主要受到γ 射线影响，因此在整个过程中可能会产生一定的干扰。为了进一步验证其受干扰情况，本次研究中，对存放了半年的γ 射线辐照产品进行了拆包检验（即对本次研究3 种样品一样、保质时间在180d 后的产品进行了1∶1 比例的灭菌分析），结果显示：3 种样品与拆包检验的产品之间均无明显差异。由此可见，γ 射线对于辐照过程的ATP 生物发光不存在干扰［5］。

为了查找可能的干扰源，经查阅读资料与交流经验后，认为对于细菌ATP 提取液发光值产生干扰的因素，可能来自辐照后的细菌所致。因此，以3种样品为准，先用生理盐水（5%）对样品进行未灭菌之前的洗脱处理，然后将其放置在培养箱中（温度设置为25℃）静置3d再对其进行辐照处理，经对样品细菌ATP提取液进行测定分析发现，ATP 提取液中的发光值存在异常［6］。另外，考虑到加入荧光素酶-荧光素反应液后出现了干扰现象，所以对加入反应液与未加入反应液的样品细菌ATP 提取液进行了对比分析，虽然没有获得明显证据，但是并不能排除直接购买的反应液中存在某些脱酸激酶存在。因此，在后续的研究中，仍然需要对直接购置的反应液进行专业研究与实验分析，搞清楚在应用ATP生物发光技术时潜在的干扰源等。

3 结语

综上所述，农产品生长于土壤环境，携带着各种细菌，食用后会对人体产生一定的危害。因此，在现代农产品生产制造、加工储存中，普遍应用了辐照灭菌技术保障其安全。为了有效达到对此类技术的应用效用，在常用的辐照灭菌技术方面，可以结合ATP 生物发光技术开展微生物检验，提高农产品辐照灭菌效果的快速测试效率，从而保障辐照灭菌技术的应用效用。结合以上初步分析可以看出，辐照农产品样品测定中细菌总数与细菌ATP 发光强度之间存在相关性，辐照灭菌处理条件下，ATP 生物发光技术会对样品检测过程产生相应的影响，造成这种影响的因素可能来自反应液质量与灭菌后的细菌感染。因此，应该对其开展进一步研究。