Xpert MTB/RIF技术在附睾结核快速诊断及利福平耐药性分析与研究

赖海斌，周静，陶俊，曾忠

（江西赣州市第五人民医院结核科，赣州 341000）

结核病是结核分枝杆菌复合群（包括结核、牛、非洲和田鼠分枝杆菌）和麻风分枝杆菌感染人体引起的一种常见的传染性疾病，临床主要是根据患者不同的感染部位命名，如常分为肺结核、淋巴结结核、骨结核、泌尿系结核、肝结核等。在男性生殖系统疾病中附睾结核是一种常见的肺外结核，也是引起男性不育的重要病因，在泌尿生殖系统疾病中比较容易被误诊[1-2]。当前临床鉴定MTB仍然以传统罗氏固体培养及液体培养作为金标准，抗酸染色检测廉价，但检出率有限，同时MTB培养法所需时间长，检测过程中易受污染，导致部分患者难以早期获得相应治疗[3-4]，荧光定量核酸扩增技术（Xpert MTB/RIF）检测技术是临床上较为常用而且快速的一种结核病诊断技术，常规用于结核病患者痰液、支气管镜肺泡灌洗液标本及其他结核病变部位标本检测结核分枝杆菌及是否对利福平耐药，在临床应用中具有较高的敏感性、高特异性，生物安全性好、检测时间短等优点。2010年WHO推荐在临床Xpert MTB/RIF检测技术可用于肺结核痰标本的检测[5]，2013年WHO推荐Xpert MTB/RIF可以替代抗酸杆菌涂片、罗氏培养等技术用于结核分枝杆菌病的快速诊断。目前临床上Xpert MTB/RIF检测技术用于在附睾结核标本的检测中尚无相关文献报道，本文为进一步探析Xpert MTB/RIF技术用于附睾结核患者诊断及利福平耐药性检测中的临床价值，收集80例患者入组观察，具体报道如下。

1 资料及方法

1.1 基础资料 纳入本院2018年1月至2020年12月疑似附睾结核患者80例。疑似附睾结核患者入选标准：有肺结核病史、症状、体征，可触及的附睾肿大；附睾穿刺所得脓液行病理学检查提示结核可能；具有助于诊断的CT、MRI与B超检查结果；附睾结核的确诊标准：满足以上疑似附睾结核性入选标准后加以下任何一点：附睾抽取标本涂片找TB阳性及标本行结核基因检测阳性，结核病方案治疗有效；附睾抽取标本行固体或液体培养阳性，同时菌种鉴定排除非结核分枝杆菌（NTM）。知情此次研究内容，自愿加入，且已同我院签订相关协议；精神正常，无老年痴呆、严重精神分裂、认知功能障碍。排除标准：有凝血功能异常、自身免疫相关性疾病；严重肝功能异常，心功能不全，呼吸衰竭，肾衰竭；查验基础资料有缺损。80例患者年龄19~65岁，平均（45.5±19.5）岁。本方案的研究方法及患者知情情况均已通过我院伦理委员会的审查讨论并批准。

1.2 实验材料及仪器试剂 穿刺采集肿大附睾脓液80份，传统罗氏固体培养法（人工）以及罗氏培养管（珠海贝索生物技术有限公司），Xpert MTB/RIF检测技术由美国Cepheid公司研发，以半巢式荧光定量PCR技术为基础，可同时对临床收集的标本进行结核分枝杆菌及利福平耐药性检测，检测仪器是全自动化，并且是一种全密闭检测平台。

1.3 方法

1.3.1 MTB培养及检测 取脓液样本1mL，使用40g/L的NaOH（氢氧化钠）溶液处理样本，接种于MTB培养基，于35℃环境中孵育，进行为期4周的连续观察，见MTB培养斜面有MTB菌落生长则记为阳性，反之阴性。

1.3.2 Xpert MTB/RIF检测Xpert MTB/RIF技术具体操作步骤如下：将临床收集的标本进行冰冻处理，再根据Xpert MTB/RIF检测流程，将冰冻标本沉淀物解冻，取1 mL标本液，同时在标本液中加入1.5 mL标本处理液，轻微混匀标本后放入室温孵育15 min；依据仪器的检测操作流程，取2 mL处理后的标本加入到一次性的标本盒中，然后将标本盒置入4通道GeneXpert平台中自动运行。加入标本盒后约2 h，Xpert检测系统可自动读出结核分枝杆菌检测结果与利福平耐药结果。结果评估参照探针循环阈值（Cycle threshold，Ct)，内对照探针Ct值≤38即为阳性，反之无效，提示标本DNA提取含有PCR抑制物或不合格；5个探针中至少有2个探针Ct值≤35提示检测结核分枝杆菌阳性，同时也可进行半定量测定。参考值分别是高含量：Ct值＜16，中等含量：16~22，低含量：23~28，极低含量：＞28。

1.3.3 药敏试验 借助比例法将分离菌株研磨制为2-10 mg/mL及4-10 mg/mL的混悬液，各取0.01 mL菌液置于利福平培养基、对照培养基，于37℃恒温箱内进行为期4周的培养观察。

1.4 观察指标 记录80例患者的临床表现，以传统罗氏固体培养法为参照计算Xpert MTB/RIF技术检测符合率，最终以传统罗氏固体培养的菌种分型及药敏结果为参照标准，统计计算Xpert MTB/RIF检测技术在MTB检测及其利福平耐药性的符合率、灵敏度、特异性。

1.5 统计学分析 使用SPSS 21.0软件进行统计学分析，其中以[n（%）]作为疾病诊断的符合率、灵敏度等计数资料，最终完成χ2检验，P＜0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者临床表现情况

本次收集80例疑似附睾结核患者主要临床表包括肿块、消瘦、畏寒、盗汗、咳嗽、咯痰、憋气等。见表1。

表1 80例疑似附睾结核临床表现统计结果[n（%）]

2.2 利福平药敏试验结果 本次利福平药敏实验中培养法共计检出MTB利福平耐药18份（25.71%），敏感52份（74.29%），Xpert MTB/RIF技术检测中检出利福平耐药17份（21.25%），敏感53份（75.71%），其中敏感样本中1份样本为假敏感。见表2所示，应用Xpert MTB/RIF技术检测MTB利福平耐药情况其符合率、灵敏度、特异度与培养法差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两种检测方法利福平耐药性检测符合率、灵敏度、特异度比较

3 讨论

泌尿生殖系统结核是因结核分枝杆菌感染引起的一种常见的难治感染性疾病，男性附睾结核出现附睾积液或附睾脓肿，在临床诊治过程中容易被误诊、误治，延误患者治疗或就诊泌尿外科行手术切除治疗，最终导致不育或术后伤口溃烂无法愈合，严重影响患者生理及心理，加重经济负担，影响生活质量。附睾结核在疾病早期阶段无明显临床症状，附睾无不适感，临床上也无明显的低热、盗汗等结核全身中毒表现，且附睾结核的发病率通常较低，而且附睾结核病灶病变部位特殊，早期该病急性发作时，与附睾炎、精索发炎症状十分相似，附睾结核病理变化主要有干酪样坏死、肉芽组织形成、纤维化、钙化等[6]，这些病理演变复杂多变，或单独存在，或同时存在，与急性细菌性附睾炎、慢性附睾炎急性发作、阴囊肿瘤性疾病合并感染等非结核性疾病不易鉴别，易造成漏诊或延误诊断，临床上因此容易被忽视，大部分出现附睾体尾部不规则肿块，肿块逐渐蔓延至附睾头体部、睾丸，甚至形成阴囊冷脓肿，继而出现脓肿破溃、窦道形成。附睾结核的诊断及治疗在临床上面临极大挑战，疾病中晚期常出现切除附睾、睾丸的严重后果，较易误诊，因此对附睾结核的早期诊治极为重要[7-8]。目前诊断结核病的主要方法包括抗酸染色镜检、MTB培养法、线性探诊技术、基因芯片技术、Gene Xpert检测系统等[9]，目前临床常用的传统检测方法主要有抗酸杆菌涂片找TB、传统罗氏固体培养，960液体培养、术后病变组织病理检查等。临床结核病诊断均以传统罗氏固体培养结果作为该疾病的诊断标准，诊断结果准确率高，但是结核罗氏培养时间比较长，获得阳性检测结果最短需要2周时间，最长需要5周以上，而如果是阴性结果，则需要2月以上时间，耗时太长，延误疾病治疗，导致疾病进一步加重，导致患者难以接受[10]。临床常用的抗酸杆菌涂片检测率低，较难检测出阳性结果，只有标本的结核分枝杆菌菌量浓度＞1000个/mL，才有可能出现TB阳性。目前临床传统罗氏固体培养法较单纯抗酸涂片检测有明显优势，标本中如果含有10~100个活菌，就能培养出TB阳性结果，也能行菌种鉴定及药敏试验，鉴别排除NTM，但唯一的缺点是耗时比较长，常需要6~8周时间[11]。附睾结核病属于肺外结核，病灶处含氧量低，并不适合结核分枝杆菌生长，故含菌量较少，临床常规检测方法无法检测，而固体培养、960液体培养法也不能有效的快速做出诊断，导致附睾结核患者不能明确诊断，得不到及时药物治疗，促使病变进一步发展恶化。

Xpert MTB/RIF检测技术是一种基于realtime PCR的技术，临床能快速检测结核分枝杆菌，并且能检测利福平耐药基因突变，常规用于临床肺结核的诊断和利福平耐药的诊断[12-13]。Xpert MTB/RIF检测主要是以半巢式荧光定量PCR为工作基础，通过自动化仪器在全封闭检测平台完成检测标本纯化、标本细菌核酸的扩增、提取纯化及浓缩等检测流程。整个试验流程都是在封闭的标本盒中完成。Xpert MTB/RIF技术针对结核杆菌rpoB基因81bp利福平耐药核心区间设计引物、探针，检测结核杆菌是否发生针对利福平突变，进一步明确是否为结核分枝杆菌以及是否对利福平耐药做出临床诊断，协助临床制定有效的治疗方案，而最终检测时间仅需要2 h就可以获得诊断结果[14]，为临床医生提供稳定、准确的检测结果。既往传统的检测方式耗时较长，准确率低，Xpert MTB/RIF检测技术能够有效的弥补此方面检测的缺陷。临床上因为医生制定治疗方案的不规范，患者用药的不规律性，菌种鉴定的不完善，导致继发性耐药结核的发病率不断升高，因此在早期获得结核分枝杆菌的药敏试验结果及菌种鉴定结果，有助于临床医生制定合理的抗结核治疗方案，缩短治疗疗程。故在附睾结核疾病早期，如果有一种简易而快速的检测方法能够提高其诊断阳性率，则能有效提高患者的治愈率，减轻患者经济负担，缩短治疗疗程，避免手术切除治疗，改善附睾结核患者生活质量。

此次观察中Xpert MTB/RIF技术用于MTB利福平耐药性检测中其符合率、灵敏度、特异度均达到95%以上，且与培养法比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明Xpert MTB/RIF技术在MTB耐药性检测中与传统培养法效能基本一致，黄建斌等人[15]的研究结果显示，Gene Xpert Mtb/RIF检测耐药度为100.00%与传统罗氏药敏结果一致，且特异度为96.55%与传统药敏结果100.00%差异无统计学意义（P＞0.05）。本次研究结果、结论与该研究基本一致，可进一步证实Xpert MTB/RIF技术在附睾结核患者诊断及利福平耐药性分析中的临床应用价值。

综上所述，证实了Xpert MTB/RIF技术在疑似附睾结核快速诊断中的临床价值，也为附睾结核患者寻找一种敏感、快速且特异性高的新技术，降低本病的漏诊或误诊率，在早期诊断、鉴别诊断及治疗提供准确可靠的依据，避免因脓肿切除附睾等风险，其诊断效能及MTB利福平耐药性分析的灵敏度、特异度与培养法一致，可积极在临床推广。