ZEB1和ZEB2在子宫腺肌症患者中的表达及意义

朱虹，吴绿，黄文倩，邹霞，李云凤，高军

（1.南昌市第一医院妇产科；2.南昌大学第三临床医学院，南昌 330006）

子宫腺肌症作为一种常见的妇科疾病，其特征是子宫肌层内存在间质和子宫内膜腺体，伴随着与子宫肌层相邻的结缔组织的增生和肥大，最常见的症状是进行性痛经、异常子宫出血、慢性盆腔疼痛和月经过多[1]，但其发病机制和病因目前还不清楚。子宫腺肌症是一种良性疾病，但其生物学行为类似于恶性肿瘤，如异常增殖、迁移和侵袭[2]。有研究表明子宫腺肌症的发生发展与上皮间质转化（EMT)密切相关[3]。EMT是指上皮细胞获得间质细胞的特性，失去上皮细胞的表型，以增强其侵袭及抗细胞凋亡能力的过程[4-5]。E-钙黏蛋白（E-cadherin）主要分布于上皮细胞中，与维持上皮细胞的表型密切相关，是一种关键的细胞粘附分子，E-cadherin表达减少是EMT的一个重要标志[6-7]。E-cadherin的下调被几个转录因子抑制，包括ZEB1、ZEB2、SNAI1、SNAI2、Twist1、Twist2和E12/E47[8]。其中，ZEB家族(ZEB1/ZEB2)为锌指转录因子代表，作为EMT的核心转录因子，与启动子中E-box相互结合，抑制E-cadherin的表达，促进EMT的发生[9]。本研究中，我们通过免疫组化方法检测ZEB1、ZEB2在子宫腺肌症内膜及正常子宫内膜的表达差异，为子宫腺肌症的发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年6月至2020年3月于南昌市第一医院妇科就诊的35例子宫腺肌症患者行全子宫切除的子宫内膜组织作为实验组，10例因宫颈上皮内瘤变行全子宫切除的内膜组织作为对照组。通过查询南昌市第一医院病历信息系统，收集子宫腺肌症患者的临床特征包括患者的年龄、痛经情况、绝经状态、孕次、产次、月经周期、血清CA125水平等内容。其中子宫腺肌症患者的年龄范围36～55岁，平均年龄为（45.26±4.455岁）。

1.2 主要试剂 本试验采用HE染色和免疫组织化学方法检测；兔源ZEB1多克隆抗体、兔源ZEB2多克隆抗体购自美国Abcam公司；DAB显色试剂、免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色 组织经石蜡包埋，切片后，烤片，然后脱蜡，水化。将已放入蒸馏水后的切片放入苏木精(AR1180-1，博生德)水溶液中染色3 min，盐酸乙醇分化液分化15 s，稍水洗，Scott返蓝液(G1865，Solarbio)返蓝15 s，流水冲洗，伊红(AR11800-2，BOSTER)染色3 min，流水冲洗，脱水，透明，封片，镜检。

1.3.2 免疫组化 组织石蜡切片水化后使用柠檬酸缓冲液高压加热修复抗原。3%双氧水室温孵育10 min，以去除内源性过氧化物酶封闭液。在玻片上滴加5%BSA，37°C封闭30 min。每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗：ZEB1（1∶200）、ZEB2（1∶500），放入湿盒中，4°C孵育过夜。之后滴加二抗工作液，37°C孵育30 min。DAB显色5~10 min；苏木精复染3 min，盐酸酒精分化，返蓝；自来水冲洗1 min，脱水、透明、封片、镜检。

1.4 结果判定 免疫组化结果判定指标为细胞浆／细胞膜内棕黄色颗粒状着色即为阳性。判定标准采用半定量评分法。免疫组化标记结果结合细胞染色的百分比及染色强度进行判定。染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比：无阳性细胞为0分，l%～为1分，10%～为2分，50%～为3分，75%～。为4分。2项评分乘积≤4为阴性，＞4分为阳性。免疫组化结果由两位经验丰富的病理医生通过双盲法判定。

1.5 统计分析 所有数据均用SPSS19.0进行统计分析，组间采用卡方检验，ZEB1、ZEB2与患者的临床病理特征的相关性采用Pearson相关性分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ZEB1、ZEB2蛋白在子宫腺肌症中的表达情况ZEB1在子宫腺肌症内膜和正常子宫内膜中的阳性表达率分别为74.29%（26/35）、30.00%（3/10）；ZEB2在子宫腺肌症内膜和正常子宫内膜中的阳性表达率分别为22.86%（8/35）、20.00%（2/10）见图1～2。ZEB1在子宫腺肌症子宫内膜中阳性表达显著高于正常子宫内膜（P=0.027）；而ZEB2在子宫腺肌症子宫内膜中的阳性表达与正常子宫内膜相比没有显著差异（P=0.848）见表1～2。

2.2 ZEB1、ZEB2蛋白阳性表达与子宫腺肌症临床特征的相关因素分析 子宫腺肌症子宫内膜组织中ZEB1、ZEB2的表达与患者的年龄、痛经、月经周期、孕次、产次、血清CA125水平均无明显相关性（P＞0.05），见表3～4。

图1 子宫腺肌症和正常子宫内膜组织HE染色（HE200×）

3 讨论

图2 ZE B1、ZE B2在子宫腺肌症和正常子宫内膜组织表达

表1 ZE B1在各组子宫内膜中的表达情况

表2 ZE B2在各组子宫内膜中的表达情况

表3 ZE B1在子宫腺肌症子宫内膜中表达的相关因素分析

表4 ZE B2在子宫腺肌症子宫内膜中表达的相关因素分析

子宫腺肌症是一种常见的妇科疾病，其发病机制和病理生理学尚不清楚。有研究表明上皮-间质转化(EMT)可能在子宫腺肌症的发展中起作用，导致子宫腺肌症上皮细胞的侵袭倾向增加[7]。EMT的一个关键初始步骤是E-cadherin的下调，E-盒结合锌指蛋白即ZEB蛋白，包括ZEB1和ZEB2，是EMT过程中的关键转录因子，参与EMT的调节过程，可以抑制E-cadherin的转录，从而促使EMT发生，最终使细胞获得侵袭转移能力[10-11]。ZEB1和ZEB2的结构相近，但是分子功能却不同，ZEB蛋白的表达在不同肿瘤中是不一样的。ZEB蛋白在多种肿瘤中表达，俞杨[12]等研究发现表明ZEB1和ZEB2在乳腺癌中均高表达；Doĝanlar[13]研究发现，ZEB1在胶质母细胞瘤中过度表达；Huo X[14]研究发现，ZEB2在食管癌中高表达；Moussa[15]等在膀胱癌中ZEB1和ZEB2均有表达。此外，张春云[16]等有研究表明，ZEB1和ZEB2在子宫内膜异位症患者中高表达。在本研究中，我们通过免疫组化方法检测ZEB1、ZEB2在子宫腺肌症子宫内膜及正常子宫内膜中的表达，结果显示ZEB1在子宫腺肌症子宫内膜中阳性表达高于正常子宫内膜，差异有统计学意义；而ZEB2在子宫腺肌症子宫内膜中的阳性表达高于正常子宫内膜，但差异无统计学意义。多种信号通路调节EMT的生物学过程，主要有Wnt信号通路、Notch信号通路、TGF-β信号通路、ILK信号通路等众多信号通路。Oh[17]等报道β-catenin在子宫腺肌症中表达水平升高，激活Wnt/β-Catenin信号通路，诱导ZEB1、Snail表达增加，抑制E-cadherin的表达，促进子宫腺肌症的进展。这提示我们，ZEB1在子宫腺肌症中高表达可能与EMT在子宫腺肌症中的发生有关。子宫腺肌症的发病率约为5%~70%，发病年龄呈年轻化趋势[18]，目前临床上诊断子宫腺肌症的的方法很多，但并没有良好的术前诊断方法，子宫腺肌症的金标准为病理学检查，为有创性检查；核磁共振(MRI)术前诊断准确率高，但价格昂贵，早期缺乏无创灵敏、准确度高、特异性强的诊断方法。CA125是一种肿瘤标志物，常用于筛查卵巢癌，有研究表明CA125的水平与子宫内膜的发育密切相关，血清CA125水平在子宫腺肌症患者中显著增高，是诊断子宫腺肌症最常见的血清标志物[19-20]。血清CA125在子宫腺肌症中阳性表达率高，对子宫腺肌症诊断具有重要的价值，本研究纳入的患者中CA125升高的患者占77.14%(27/35)，ZEB1在子宫腺肌症中阳性表达率为74.29%（26/35），由于血清CA125在多种妇科疾病中均有表达，特异性较差。在临床上联合检测CA125和ZEB1水平，以两者均阳性为标准，是否可以提高子宫腺肌症的准确性，需后续的进一步研究。本研究还分析了ZEB1、ZEB2在子宫腺肌症患者中的表达水平与血清CA125水平的相关性，结果显示ZEB1、ZEB2在子宫腺肌病患者中的表达水平与血清CA125水平无关。子宫腺肌症最常见的症状是进行性痛经、异常子宫出血、月经过多和慢性盆腔疼痛[1]，其中，痛经是子宫腺肌症患者主要的特征性症状，有文献报道子宫腺肌症痛经发生率达64.8%~77.8%[21]，本研究中子宫腺肌症患者痛经的比率为57.14%（20/35），这可能与本研究样本量少有关。此外我们还分析了ZEB1、ZEB2在子宫腺肌病患者中的表达水平与其临床特征的相关性，结果显示ZEB1、ZEB2在子宫腺肌病患者中的表达水平与患者的年龄、痛经、月经周期、孕次、产次和绝经状态无显著相关性，这与王慧芳[22]等人的研究是一致的。

综上所述，在本研究中，ZEB1在子宫腺肌症子宫内膜中阳性表达显著高于正常子宫内膜，可能与EMT在子宫腺肌症中的发生有关，为研究子宫腺肌症的分子机制提供参考。