针刺对缺血性脑卒中小胶质细胞影响的研究进展

李晶怡，王东岩，董 旭，霍 宏，丛 婧

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

缺血性脑卒中是导致我国成年人死亡和永久残疾的主要原因，占成人脑卒中的87%[1]。脑组织损伤通常发展迅速且不可逆转，因此及时有效的治疗是决定缺血性脑卒中预后的关键因素。小胶质细胞是中枢神经系统(Central Nervous System，CNS)中的一种驻留免疫细胞，对脑实质具备持续监测作用。当局部CNS内环境发生变化时，小胶质细胞可被激活并改变其表型，其促炎及抗炎作用对缺血性脑卒中的预后起主要影响[2]。针刺作为中医学必不可少的疗法，在缺血性脑卒中的治疗中具有显著作用，且临床疗效与小胶质细胞的表达有一定联系。本研究对针刺对缺血性脑卒中小胶质细胞影响的相关机制展开论述，望为后期的实验研究和临床医治提供理论基础及思路。

1 小胶质细胞的概述

小胶质细胞，由西班牙神经科学家Pío del Río-Hortega首次提出，并将其命名为CNS的“第三元素”。在啮齿动物中，约占CNS细胞的5%～12%[3]。在人类中，占所有CNS细胞的0.5%～16.6%，且相较于灰质，其在白质区的含量更高[4]。

最近的命运图谱研究清楚地表明，小胶质细胞起源于胚胎外卵黄囊中的早期红细胞髓系祖细胞，能够独立于造血干细胞而进行自我更新，经发育程序逐步分化为成熟的小胶质细胞[5]。经转录组分析证实，小胶质细胞在血脑屏障成熟后分别具有不同的活化状态及功能。发育中和出生后早期的小胶质细胞通常显示出“通用巨噬细胞”样及可移动的变形虫形态，而成人脑中的小胶质细胞具有能够探测周围环境的特有分支延伸[3]。

事实上，大量证据已经揭示了CNS中小胶质细胞的表型多样性。通常将其简化分为M1、M2表型。然而，有学者提出小胶质细胞极化的M1和M2表型并不适用于体内实验。在生理条件下，小胶质细胞被认为处于稳态表型，因为它们在维持大脑稳态方面发挥主要作用。当受到内源性或外源性刺激时，小胶质细胞会被迅速激活，发展为DAMs表型或MGnD表型[6]。这两种表型在如今的研究中应用较为广泛。

小胶质细胞是一种驻留免疫细胞，在促进神经元发育、维系体内平衡及CNS神经结构的建立中发挥关键作用[7]。在正常的大脑中，小胶质细胞向突触延伸，并不断监测突触的活动。在这种监视过程中，小胶质细胞主动吞噬突触并控制它们的数量，即“突触修剪”，其对发育中大脑的神经回路形成及成熟大脑中的稳态具有推动和维持作用[8]。小胶质细胞对大脑发育的贡献还包括参与突触消除、突触重塑以及清除凋亡细胞等活动。

2 小胶质细胞在缺血性脑卒中中的作用

小胶质细胞作为免疫系统的组成部分及脑卒中的“主要反应者”，可被激活和极化以响应与卒中相关的刺激。其典型的双向作用对卒中的预后起重要作用，主要表现为形态分化、迁移、吞噬以及释放生物活性物质，如细胞因子/趋化因子、活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和神经保护因子等。这些因子的合成及分泌在损伤的大脑中既具有神经毒性，也具有神经保护作用。具体而言，其产生的炎症因子可改变血脑屏障(Blood brain barrier，BBB)的通透性，吞噬血管内皮细胞，使BBB在卒中发生后分解，进而阻碍大脑的恢复进程；但同时，其分泌的抗炎因子及神经保护因子具有调节炎症、去除坏死组织与促进神经再生等作用均有利于损伤大脑的恢复[9]。其通过两种相反的病理生理作用维持卒中后CNS微环境的稳态，这两种作用在脑损伤后的恢复中起至关重要的作用。

2.1 小胶质细胞的抗炎作用

小胶质细胞作为卒中后的第一道防线，通过清除细胞碎片、抑制炎症介质引起的血管扩张、释放神经营养因子及修复受损组织，改善缺血性脑卒中的预后转归。其在缺血后1 h后被迅速激活，促进细胞迁移，并激活下游细胞信号传导[10]。在缺血事件发生几天后，小胶质细胞可能会分泌神经保护因子、高水平表达“抗炎”因子，如CD206、白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)[11]。TGF-β1的异构体在脑损伤后亚急性期和慢性期会产生大量的抗炎细胞因子，其分子持续强烈地抑制IKB的磷酸化，以阻止主要的促炎转录因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)的激活[12]。

通常，在缺血后的慢性期，存在于缺血半暗带区存活的神经元通常是可挽救的，它们在缺血半暗带和细胞碎片中积累。半暗带中的小胶质细胞携带较大的吞噬体，可表达NG2并吞噬死亡或垂死的细胞。小胶质细胞常在缺血核心区发生迅速凋亡[11]。据Szalay G[13]等研究，小胶质细胞的耗竭会使梗死体积增加60%，而小胶质细胞的再增殖可以逆转这种情况。

损伤相关分子模式(DAMPs)与缺血核心区中的TLR和P2X7受体的结合可导致累积的小胶质细胞中的代谢从OXPHOS转变为糖酵解[14]。研究结果表明，缺血大脑中的炎症细胞依赖厌氧糖酵解产生ATP来进行炎症反应。抑制或选择性敲除糖酵解中的限速酶己糖激酶2(HK2)可抑制小胶质细胞的激活和IL-1β的产生从而达到保护缺血性脑损伤的效果。

刘氏等[15]认为，转录因子核因子E2的相关因子(NRF2)可能是治疗缺血性脑损伤的一个有希望的靶点。NRF2不仅能提高ROS的清除能力、调节ROS的产生，在小胶质细胞激活NRF2后还发挥抗氧化及抗炎作用[16]。此外，STAT6信号似乎诱导小胶质细胞的抗炎表型。有研究将 STAT6确定为关键转录因子，认为其可在中风后早期介导小胶质细胞中发挥有效的胞吞作用和抗炎反应。ARG1也被认为是对小胶质细胞有益的生物学标志物，并且在病理条件下具有组织修复特性，且小胶质细胞的ARG1+表型已被证明可以防止神经元死亡并促进损伤后的神经突触生长[10]。

2.2 小胶质细胞的促炎作用

虽然小胶质细胞具有清除细胞碎片和异物的能力，但脑卒中的发生会削减小胶质细胞的清除能力，最终可致神经元损伤及BBB分解。且缺血性脑卒中后的早期反应主要是促炎症反应，当小胶质细胞过度激活时，会释放IL-8和TNF-α等促炎细胞因子，导致脑损伤后的神经炎症反应，从而抑制CNS修复。这种抗炎和促炎的功能,常以“双刃剑”的身份存在[17]。

在急性期，小胶质细胞的过度激活所引起的特异性免疫反应，会分泌和产生促炎细胞因子，从而加重卒中的病理反应。据调查，在多种病理条件下，小胶质细胞因过度表达可诱导出促炎表型，包括暴露脂多糖(LPS)、炎症因子、缺氧和其他损伤相关分子，其中大量促炎细胞因子被复制，从而导致神经元细胞损伤。其次，用淀粉样蛋白β肽(Aβ)刺激小胶质细胞也会激活参与促炎基因表达的转录因子，如NF-κB[18]。缺血性中风后，NF-κB在活化的小胶质细胞中被激活并从细胞质转移到细胞核中，从而诱导炎症细胞因子的产生并导致中风后继发性脑损伤[19]。此外，STAT1、STAT3的激活对炎症反应的发生均存在促进作用，加重脑损伤症状[20]。

3 针刺对脑梗死后小胶质细胞相关机制的调控

目前，溶栓治疗仍为缺血性脑卒中的首选特异性治疗手段，不过由于其对发病时间及病患个体情况均有较高要求，导致我国的溶栓率仅有2.5%。针刺疗法作为中医学经典疗法，早在西汉后期就已成熟，具有副作用小、见效快等优势。其在缺血性脑卒中后的治疗及康复中均有较高疗效，在国内外临床应用上屡见不鲜。近年来，针刺对小胶质细胞的作用机制研究成为热点话题，通过改善小胶质细胞的活化及表达以影响缺血性脑卒中预后的相关研究也层出不穷，下面笔者将展开具体概括。

3.1 调控miRNA

外泌体miRNA参与细胞增殖、自噬、凋亡、分化及代谢等生理病理过程，针对修复缺血性脑卒中损伤的作用也已得到证实。Zhao H等[21]，证明miRNA-23a-3调控超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)水平,上调和减少活性氮类(Reactive nitrogen species，RNS)的产生，以减轻小鼠的缺血性损伤。且有研究表明，通过靶向颤蛋白(reelin)以抑制miRNA-200c的表达可显著减少梗死体积和神经功能缺损程度[22]。同时，miRNA-137在CNS中大量表达，参与小胶质细胞外泌体的作用，是调节大脑保护反应所必需的miRNA[23]。

电针疗法作为针刺疗法的一个分支，是一种以毫针与电刺激相结合的治疗方法。其具有促进神经功能损伤的恢复、减少炎症反应等功效。此外，电针疗法通过促进抗炎小胶质细胞更新、抑制促炎小胶质细胞激活以平衡小胶质细胞的极化作用。随着对miRNA参与抗炎通路的研究，于涛等[24]发现，电针治疗可抑制miR-21的表达水平。神庭穴、百会穴作为督脉腧穴，具有改善神经运动及认知功能等疗效，故其通过选取神庭、百会二穴施以电针治疗，发现电针明显降低MCAO大鼠脑皮层区miR-21水平、减小神经元凋亡数量及降低神经功能缺损评分。黄秀容等[25]研究结果表明针刺百会、印堂穴可增强脑卒中抑郁大鼠神经传导功能、上调miRNA-219表达，改善大鼠的神经运动功能。刘思彤等[26]通过观察电针对MCAO大鼠miRNA表达的影响中发现，miR-743a-3p、miR-11980-z、miR-871-3p、miR-743b-3p、miR-741-3p、miR-6715-x与novel-m0082-3p在电针后的表达明显上调(P<0.05)，是电针发挥上调作用的显著效应靶点；且推测电针疗法通过上调miR-743b-3p，以改善卒中结局。

3.2 抑制MMP-9的表达

基质金属蛋白酶(Matrimet allopreinase,MMPs) 既可以由血脑屏障进入体循环，也可以通过内源性释放和激活[27],其存在与炎症过程及BBB的损伤均密切相关。最近的数据表明，抑制MMPs的表达可能成为治疗缺血性脑卒中的新方向。MMP-9由中性粒细胞衍生，在缺血性脑卒中发生后，MMP-9阳性细胞的表达增多，通过降解脑血管基质的关键成分,基膜的紧密连接结构遭到破坏，加重BBB破坏，导致脑水肿和功能损伤[28]。MMP-9还会增加缺血半暗带中的神经元损伤，从而增大脑梗死体积。此时小胶质细胞被激活并协调大脑的炎症反应，其替代激活参与卒中后神经血管重塑期间的BBB恢复[29]。

电针预处理旨在缺血性脑卒中前给予电针干预，以诱导脑缺血耐受，发挥脑保护效应。督脉中的百会穴及风府穴，具有通关开窍之功。陈丽莹等[30]在大鼠脑梗死形成前后分别针刺/电针百会穴和风府穴，结果显示针刺及电针预处理均能降低MMP-9表达，缩小组织损失并促使缺血区的血管生成,对修复BBB重塑起积极作用。其次，卒中后溶栓也会引起MMP-9表达升高，刘李静[31]通过蛋白质免疫印迹对比发现MMP-9在电针治疗后的表达水平低于溶栓后，且认为电针可能通过抑制MMP-9的过度表达，从而保护BBB、减少脑梗死体积。李梦雪等[32]发现“醒脑开窍”针法配合药物治疗的第5天、第10天后改良 Barthel 指数评分、NIHSS评分与MMP-9的表达均较普通针刺显著降低，且中医症候、西医疗效的总有效率均明显高于对照组(P<0.05)。提示“醒脑开窍”针法可显著降低MMP-9的表达，改善患者日常生活活动能力。

3.3 抑制NLRP3、NF-κB的表达

NOD样受体3 (NLRP3) 炎症小体在神经免疫反应中起重要作用，调节NLRP3炎症反应被认为有利于改善缺血性卒中的神经功能[33]。脑组织在发生缺血性损伤后所引起的ATP减少和ROS快速增加等多种内源性危险信号，可介导NLRP3炎症小体在缺血性脑卒中病理生理过程中的激活，包括小胶质细胞在内的免疫细胞可以通过NLRP3炎症小体释放的炎症细胞因子的突然增加而聚集，以清除DAMPs。但NLRP3炎症小体的过度激活会导致炎症持续释放，从而引起再灌注后的继发性脑损伤，故可通过抑制NLRP3炎症小体有效预防脑损伤的加剧[34]。该炎症小体可被各种内源性及外源性的危险信号诱导，进而激活Caspase1，这一作用可能促进IL-1β、IL-18的成熟和释放以及包括NF-κB和TNF-α在内的炎症基因表达的增加[35]。

不仅如此，大量研究表明，NLRP3的表达可通过减少与小胶质细胞相关的炎症反应和神经元损伤，达到减轻梗死体积和修复神经血管损伤的目的，以改善缺血预后[36]。邓寒冰等通过选取阳陵泉、关元、照海与申脉等穴位施以电针刺激后，脑组织中NLRP3、Caspase1与pro-caspase-1表达水平显著降低、神经元凋亡数量、小胶质细胞树突及轴突均减少，提示电针疗法可通过抑制NLRP3、Caspase1及pro-caspase-1在小胶质细胞中的表达而减缓炎症反应，改善运动神经元的损伤及提高神经系统评分[37]。该团队[38]还对缺氧缺血性脑损伤的新生大鼠选择脑三针、智三针与颞三针穴进行电刺激，证实电针治疗后的大鼠脑梗死体积明显降低、海马区的神经细胞损伤减轻，伴随cleaved-caspase-1+tunel+细胞减少，认为电针可能通过减少TXNIP/NLRP3通路所介导的神经细胞焦亡，促进神经功能恢复。此外，董苗苗等[39]研究通过脑缺血再灌注后选择患侧合谷、尺泽、三阴交与足三里进行电针治疗，与模型组比较发现脑组织中小胶质细胞含量、NLRP3 和 Caspase 1的表达均降低，神经细胞凋亡程度减少，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，曹冰倩[40]也发现电针可明显抑制NLRP3/caspase1细胞焦亡通路中NLRP3、Caspase1与1L-1β的表达，减少远隔损害。

在缺血性脑卒中发生后，NF-κB常被活化的小胶质细胞激活，参与诱导多种炎症介质基因的表达，是炎症反应中的首要因素。当大脑缺血受到刺激后，可致促炎因子、细胞毒性物质与蛋白水解酶等释放。在NF-κB信号通路中，IκB激酶(IκB kinases,IKK)作为重要的上游激酶，可直接活化NF-κB通路并诱导炎症级联反应，同时IKKβ是激活该通路中所必需的IKK亚基[41]，过表达IKKβ基因会严重加重神经功能损伤，影响缺血性脑卒中结局。秦文熠等[42]发现，在缺血发生后IKKβ表达发生明显上调，而电针刺大鼠百会穴、合谷穴及太冲穴后，活化的小胶质细胞被明显抑制、IKKβ蛋白表达亦明显减少，同时脑梗死体积缩小、神经系统评分得以改善。该团队明确电针治疗能以IKKβ为主要靶点，抑制NF-κB信号通路过度表达，从而降低炎症反应的发生率。张俊川等[43]通过动物实验发现，选择双侧内关穴、足三里穴通过电针治疗MCAO大鼠后与未经治疗的模型组相比，在第7天、第14天的大鼠运动功能评分降低、Cys C含量下降、TNF-α和NF-κB 阳性表达减少(P<0.05)。曲良等[44]通过针刺百会、四神聪穴治疗缺血再灌注损伤大鼠与非穴区对照组进行比较发现，针刺组大鼠缺血半暗带脑组织中NF-κB蛋白表达水平显著降低，IκB蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.4 促进CB2R的表达

内源性大麻素系统已被提出是包括缺血性脑卒中在内的多种神经系统疾病的重要靶点[45]。其中CB1R和CB2R是目前受到讨论最多的大麻素受体。CB1R主要由神经元表达，CB2R主要由免疫细胞表达，与调节迁移、细胞因子产生和抗原呈递有关[46]。事实上，越来越多的证据表明刺激CB2R可抑制多种神经因子的释放、调节小胶质细胞迁移和增殖[47]。二者在小胶质细胞中表达的过程中，还具有调节、保护神经和降低毒性反应等功能。在炎症早期，CB2R在CNS中表达上调以调节免疫应答。

针刺预处理指在缺血性脑卒中前施针，继而在缺血后发生脑保护效应。黄丽等[48]证实，针刺预处理在改善脑血液循环、维持细胞存活及预防缺血性卒中等方面均有效。且据相关研究，电针预处理可经CB2R、CB1R调控小胶质细胞极化，进而减少细胞凋亡数量、缩小脑梗死体积和诱导脑缺血耐受[49]等。

4 小结

综上，小胶质细胞具备持续自我更新，释放抗炎因子及促炎因子的能力，对缺血性脑卒中治疗结局也发挥着双向作用。其中，小胶质细胞作为卒中后的第一道防线，其抗炎作用对缺血性脑卒中的预后转归发挥了重要的修复及保护作用。但过度激活小胶质细胞，会导致促炎因子的大量分泌，加重脑梗死症状。故精确调控小胶质细胞的活化是对缺血性脑卒中恢复治疗的关键要素。针灸作为中国古代文化的瑰宝，已被广泛地应用于临床。日益更新的针刺疗法(如电针疗法)也对疾病的康复具有积极影响。目前，大量的临床研究已证实针刺可以从多个角度改善缺血性脑卒中，其作用于小胶质细胞相关因子改善受损功能现已得到验证，具有理论根据并且有实验结果依附，但探析针刺对小胶质细胞具体作用机制的深度还远远不够，未来需多维度地深入探索其潜在的作用机制，以期为基础实验及临床治疗提供更扎实的理论基础及更新颖的治疗方向。