SEPT9基因甲基化检测联合CA199和CEA在结直肠癌诊断中的应用价值

宫晓红，马天舒，朱鸿

（1.大连市中医院检验科，辽宁 大连 116001；2.大连医科大学附属第一医院检验科，辽宁 大连 116011）

结直肠癌是临床常见的胃肠道恶性肿瘤，发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第4位和第2位[1]。大部分的结直肠癌在确诊时已处于中晚期，错过了最佳的治疗时期。目前对中晚期的结直肠癌患者主要采取化疗控制疾病的发展，延长生存期[2]。进行结直肠癌筛查的检测手段主要是粪便潜血和肠镜。粪便潜血试验虽然简便、无创、经济，但干扰因素较多，假阳性率高[3]。结直肠镜是诊断结直肠癌的金标准，但大部分患者的依从性较差，高危人群的筛查率＜20%[4]。糖类抗原19-9（CA199）、癌胚抗原（CEA）在结直肠癌患者中明显升高，具有较高的灵敏度，可用于辅助诊断[5]。近年来，研究[6]发现，结直肠癌在进展过程中，SEPT9基因5，端CpG岛常发生高度甲基化，导致SEPT9基因表达下降，从凋亡坏死的癌细胞释放入血。因此，血浆中游离的DNA中mSEPT9可作为结直肠癌敏感性的肿瘤标志物。本研究旨在探讨SEPT9基因甲基化检测联合CA199、CEA在结直肠癌诊断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年6月至2020年6月于本院肛肠科住院的200例患者的血液样本，其中70例结直肠癌患者的血液样本作为A组，男40例，女30例；平均年龄（63.2±8.7）岁。130例结直肠腺瘤患者的血液样本作为B组，男85例，女45例；平均年龄（64.2±9.4）岁。纳入标准：符合《中国临床肿瘤学会结直肠癌诊疗指南（2019版）》综合诊断标准。排除标准：其他恶性肿瘤；接受过放化疗治疗；腹部手术史；妊娠期女性。同期收集本院体检中心100名健康体检者的外周血样本作为C组，男57例，女43例；平均年龄（63.8±10.1）岁。3组年龄、性别等临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会审核批准。患者及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 所有研究对象均于空腹8 h以上于第2天早晨8:00抽取2管静脉血标本。一管EDTA抗凝2 ml，一管无抗凝剂3 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血浆和血清。CA199、CEA采用贝克曼DXI-800进行检测，参考范围是0～35 U/ml、0～5 ng/ml。mSEPT9检测方法：离心后的血浆吸取3.5 ml置于新的离心管，加100 ml磁珠，室温旋转混匀45 min。弃去上清液，吸取底部磁珠2 ml置于Eppendorf管，待磁珠吸附后，弃去上清液。洗脱后的DNA加入硫酸盐溶液150μl，80℃孵育45 min。加入磁珠结合，洗涤磁珠，待干燥后洗脱DNA，进入PCR检测阶段。采用仪器为ABI7500 Fast DxPCR仪，每个样本进行3次重复检测。每次实验同时进行阴阳性对照作为质控标准。结果判定：3个测试结果中，2个及以上Ct值＜45，判定为阳性，反之判定为阴性。

1.3 观察指标 比较3组血清CA199、CEA水平，3组mSEPT9、CA199、CEA阳性率，mSEPT9、CA199、CEA在结直肠癌患者不同分期中的灵敏度，3组mSEPT9、CA199、CEA诊断效能。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用F检验；计数资料以（%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。采用ROC曲线分析mSEPT9、CA199、CEA对结直肠癌的诊断价值。

2 结果

2.1 3组血清CA199、CEA水平比较 A组CA199、CEA水平均明显高于B、C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组CA199、CEA水平比较差异无统计学意义，见表1。

表1 3组血清CA199、CEA水平比较（±s）

表1 3组血清CA199、CEA水平比较（±s）

注：CA199，糖类抗原19-9；CEA，癌胚抗原

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2.2 3组mSEPT9、CA199、CEA阳性率比较 A、B、C组血浆mSEPT9阳性率分别为75.71%、11.54%、1.00%；A、B、C组血清CA199的阳性率分别为18.57%、0.00%、1.00%，CEA的 阳 性 率 分 别 为35.71%、3.08%、2.00%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3组mSEPT9、CA199、CEA阳性率比较

2.3 mSEPT9、CA199、CEA在结直肠癌患者不同分期中的灵敏度比较 根据常见肿瘤的TNM分期系统，对70例结直肠癌进行分期，分为早期26例（Ⅰ期10例+Ⅱ期16例），晚期44例（Ⅲ期18例+Ⅳ期26例）。晚期患者mSEPT9、CA199、CEA的灵敏度更高，差异有统计学意义（P＜0.05）；mSEPT9在晚期的诊断效能最高，可达82.88%（95%CI：0.633～0.937），见表3。

表3 mSEPT9、CA199、CEA在结直肠癌患者不同分期中的灵敏度比较

2.4 3组mSEPT9、CA199、CEA诊断效能比较 根据mSEPT9、CA199、CEA对结肠癌的ROC曲线分析显示，mSEPT9、CA199、CEA曲线下面积均＞0.5，具有临床诊断意义。3项联合检测的诊断效能均高于单独检测的诊断效能，见图1和表4。

图1 mSEPT9、CA199、CEA单项与联合检测ROC曲线

表4 3组mSEPT9、CA199、CEA诊断效能比较

3 讨论

根据《2018全球肿瘤统计》显示，结直肠癌已逐渐成为全世界第2位肿瘤死因，约占9.2%[7]。结直肠癌也是我国比较常见的消化道实体肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，严重威胁人类健康[8]。结直肠癌初期症状不明显，就诊时大多已发展到中晚期。虽然目前诊断和治疗方法均取得了很大的进步，但5年生存率仅为15%[9]。因此，早期筛查、早期诊断对提高患者生存率及预后极为重要。

SEPT9基因是septin基因家族的成员之一，是一种调节基因，主要参与细胞的分裂、转运、调控。人体在各种致癌因子的作用下，SEPT9的基因结构可改变，SEPT9蛋白表达受到干扰，导致细胞基因组不稳定，影响SEPT9聚合物形成，细胞向肿瘤特征转化[10]。mSEPT9在结直肠癌组织中可见，在正常组织中很少见。SEPT9基因甲基化检测是近年来出现的比较新的检测技术，是首个被美国FDA批准的结直肠癌血液基因甲基化标志物。康倩等[11-12]报道显示，mSEPT9是一种简单无创的筛查技术，在诊断结直肠癌上具有较高的灵敏度和特异度。CA199、CEA是诊断结直肠癌常规检测项目。CA199属于糖类蛋白肿瘤标志物，是肿瘤细胞的神经节苷酯，常用于消化道肿瘤的辅助诊断指标[13]。CEA是一种酸性糖蛋白，是广谱的肿瘤标志物，内胚层来源的肿瘤均可见CEA明显异常。CEA常用于诊断结直肠癌和判断肿瘤复发，而且升高的水平与肿瘤的分期呈正相关[14]。本研究结果显示，结直肠癌患者mSEPT9、CA199、CEA阳性率均明显高于其他两组，晚期结直肠患者mSEPT9的诊断效能最高，灵敏度可达82.88%（95%CI：0.633～0.937）。3项联合检测可进一步提高诊断结直肠癌的灵敏度（89.88%）和特异度（90.23%）。

综上所述，对于结直肠癌患者而言，晚期患者mSEPT9、CA199、CEA的灵敏度更高，mSEPT9诊断效能最高；mSEPT9联合CA199、CEA检测有助于提高灵敏度和特异度，对结直肠癌的早期诊断具有重要意义。但由于本研究样本量较小，随访时间较短，可能存在一定的结果偏倚，有待以后加大样本量进行进一步研究。