仙鹤草乙醇提取物通过抑制STAT3表达促进慢性阻塞性肺疾病大鼠Th17/Treg平衡恢复

李晶 陈剑超 段珊

(南华大学附属第二医院 1急诊科，湖南 衡阳 421001；2超声科；3南华大学附属第一医院呼吸科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)表现为不可逆性气流受限，一般与患者肺部对烟雾有害颗粒或气体的异常炎症反应相关〔1〕。肺部和气道壁结构破坏及慢性炎症是COPD的病理基础，患者肺功能出现障碍、衰退，严重威胁身体健康安全，目前COPD位居全球死亡病因的第4位〔2，3〕。因此，如何防治COPD是医学界面临的重大课题。现代药理研究表明，仙鹤草具有抗炎、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫功能等药理作用〔4〕。信号转导子和转录激活子(STAT)3能够维持和诱导炎症反应。研究发现，抑制核转录因子(NF)-κB信号通路，下调p-STAT3水平可有效缓解COPD肺组织炎症反应和肺损伤〔5〕。Treg在COPD发生发展中发挥重要作用，在机体正常生理条件下，Th17/Treg保持动态平衡，此时机体免疫功能灵活，一旦Th17/Treg平衡打破，Th17细胞增殖过度，可引发炎症反应，诱导COPD发生〔6，7〕。仙鹤草乙醇提取物能否通过调控STAT3通路以恢复Th17/Treg平衡，从而缓解COPD大鼠病症未见相关报道，因此本研究拟建立COPD大鼠模型作为研究对象，观察不同浓度仙鹤乙醇提取物作用后COPD症状缓解情况及对STAT3通路、Th17/Treg平衡的影响。

1 资料与方法

1.1试剂和仪器 仙鹤草乙醇提取物的制备：精确称取100 g仙鹤草粉于5 000 ml三颈瓶中，加入30%的乙醇1 500 ml，在100℃恒温水浴锅中分别冷凝回流提取100 min，趁热过滤，提取2次，合并滤液，浓缩至1 g生药/ml，等量蒸馏水洗涤，清洗至无乙醇，真空干燥，提取物用蒸馏水混悬待用〔8〕。氨茶碱片(国药准字H44021063，规格：0.1 g)购自国药集团汕头金石制药有限公司；兔抗鼠STAT3(货号：K25714-BJH)、兔抗鼠p-STAT3(货号：K28006-MUN)、兔抗鼠ROR-γt(货号：K24419-OBS)、兔抗鼠Foxp3(货号：K15477-LJR)、羊抗兔二抗(货号：BL0924-ILN)均购自北京百奥莱博科技有限公司；白细胞介素(IL)-10(货号：XY-SJH-3880)、IL-17(货号：XY-SJH-3709)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海烜雅生物科技有限公司；CUT6062型石蜡切片机购自北京天赐百年科技有限公司；Editormp601型胸部X射线检查仪购自德国西门子公司；Varioskan LUX多功能酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2实验动物 雄性清洁级SD大鼠，8周龄，体重200～250 g，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)-2018-0001。实验动物均常规适应性饲养1 w后进行实验，COPD大鼠模型构建采用Tian所建立的方法〔9〕，将大鼠持续暴露在烟雾环境中，前2 w在早、中、晚个各点燃3支烟，后10 w在早、中、晚个各点燃5支烟，此外，在前8 w，向大鼠鼻孔中滴加新配的100 μl肺炎克雷伯杆菌溶，1次/5 d。12 w后，所有大鼠行X射线检测，肺组织增厚，形态不规则说明COPD模型构建成功。实验分组：①对照组；②COPD模型组；③低剂量组(仙鹤草乙醇提取物4 g/kg)；④中剂量组(仙鹤草乙醇提取物8 g/kg)；⑤高剂量组(仙鹤草乙醇提取物16 g/kg)〔10〕；⑥氨茶碱组(2.3 mg/kg)〔11〕。每组10只，灌胃给药，1次/d，给药体积1 ml，连续给药60 d，对照组和COPD模型组灌胃等体积的生理盐水。

1.3方法 ①一般情况：观察各组大鼠精神状况、毛发光泽程度，生理活动情况、气喘、口鼻分泌物、腹泻等一般情况。②各组肺功能测定：用2%戊巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉各组大鼠，随后将完全麻醉的大鼠固定在手术台上，经大鼠口气管插入Y型气管并固定，将气管一端连接生物信号采集系统传感器，随后仪器自动扫描并绘制呼吸曲线，测定大鼠每分钟吸气峰流量(PIF)、呼气峰流量(PEF)和通气量(MV)等指标。③各组肺组织病理学观察：给药结束后，脱颈处死大鼠，立刻进行解剖，取大鼠左侧肺组织，一部分置于-80℃冰箱中待用，一部分4%多聚甲醛固定。取部分各组固定后的肺组织，石蜡包埋，切片、梯度乙醇洗脱、脱水、苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下观察肺组织病理学变化。④肺组织小气道管壁厚度测量：将各组肺组织HE切片置于光学显微镜下观察，各切片随机选取3个视野，利用微尺测量小气道管壁厚度，每个切片读取10个数值，结果取平均值。⑤Western印迹测定各组大鼠肺组织中STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表达水平：从-80℃取出各组大鼠肺组织，置于含有500 μl十二烷基硫酸钠(SDS)裂解液的研钵中，充分研磨至无组织碎片，离心取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)法测定上清液中蛋白含量。50 μg蛋白缓冲液在100℃条件下保温5 min，随后上样电泳，低压80 V，30 min，高压120 V，120 min，湿法转膜，5%BSA封闭结合位点1 h，加入兔抗鼠STAT3、兔抗鼠p-STAT3、兔抗鼠ROR-γt、兔抗鼠Foxp3、兔抗鼠内参β-actin(稀释比例均为1∶1 000)，常温孵育过夜，加入羊抗兔二抗(稀释比例均为1∶1 000)，常温孵育2 h后，显色、曝光、观察。⑥ELISA检测各组大鼠肺组织中IL-10、IL-17表达水平：从-80℃取出各组大鼠肺组织，置于含有200 μl生理盐水的研磨中，研磨均匀，离心取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作测定各组大鼠肺组织中IL-10、IL-17表达水平。

1.4统计学方法 使用SPSS22.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1大鼠胸部X射线观察 对照组肺部形态清晰可见，结构完整，COPD模型组右肺下叶边缘模糊，肺部有斑块密集、多云阴影、增厚等病理特征，见图1。

图1 两组胸部X射线观察

2.2各组一般情况观察 对照组大鼠精神状态良好，活泼好动，毛发光亮，呼吸、饮食、饮水正常。COPD模型组大鼠精神萎靡不振，毛发无光泽，身体蜷缩，大便质稀，出现咳嗽、气喘，部分有哮鸣音，鼻分泌物增多。低、中、高剂量组一般情况介于对照组和模型组之间，精神状态转好，活动频率增加，毛发恢复光泽，咳嗽、气喘症状减轻，鼻分泌物减少。氨茶碱组一般情况与高剂量仙鹤草乙醇提取物相仿。

2.3各组肺功能测定 与对照组相比，COPD模型组PIF、PEF、MV均显著降低(P<0.05)；与COPD模型组相比，低、中、高剂量组和氨茶碱组PIF、PEF、MV均显著升高(P<0.05)，随着仙鹤草乙醇提取物给药剂量升高，PIF、PEF、MV随之升高(P<0.05)。氨茶碱组PIF、PEF、MV与高剂量组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组肺功能测定

2.4各组肺组织病理学观察 对照组大鼠肺部泡组织结构完整，纤毛排列整齐且无脱落，未见管壁增厚，炎性细胞浸润。COPD模型组肺泡结构破坏，泡壁纤薄、肺泡肿大，气管黏膜部分脱落，可见大量炎性细胞浸润，管壁腔、终末细支气管远端狭窄。仙鹤草乙醇提取物给药后，随剂量增加可见肺泡间隔逐渐消失，部分肺泡融合，少量炎性细胞浸润，气管黏膜皱襞轻度变长、增多，上皮细胞少量脱落。氨茶碱组病理组织缓解情况与高剂量组相仿，见图2。

图2 各组肺组织病理学观察(HE，×400)

2.5肺组织小气道管壁厚度测量 与对照组〔(15.09±1.64)μm〕相比，COPD模型组〔(128.35±2.47)μm〕小气道管壁厚度显著升高(P<0.05)；与COPD模型组相比，低、中、高剂量组小气道管壁厚度显著降低(P<0.05)，随着仙鹤草乙醇提取物给药剂量升高，小气道管壁厚度随之降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。氨茶碱组〔(18.04±0.71)μm〕小气道管壁厚度与COPD模型组相比显著降低(P<0.05)，与高剂量组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6各组肺组织STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表达水平 与对照组相比，COPD模型组STAT3表达水平无明显变化，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表达水平显著升高，Foxp3表达水平显著降低(P<0.05)；与COPD模型组相比，低、中、高剂量组和氨茶碱组STAT3表达水平无明显变化，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表达水平明显降低，Foxp3表达水平显著升高(P<0.05)，随着仙鹤草乙醇提取物给药剂量升高，STAT3磷酸化水平、ROR-γt表达水平随之降低，Foxp3表达水平随之升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。氨茶碱组与高剂量组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2和图3。

图3 各组肺组织中STAT3、p-STAT3、ROR-γt、Foxp3表达

2.7各组肺组织IL-10、IL-17水平 与对照组相比，COPD模型组IL-10表达水平均显著降低，IL-17水平显著升高(P<0.05)；与COPD模型组相比，低、中、高剂量组和氨茶碱组IL-10水平均显著升高，IL-17水平显著降低(P<0.05)，随着仙鹤草乙醇提取物给药剂量升高，IL-10水平随之升高，IL-17水平随之降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。氨茶碱组与高剂量组相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3 讨 论

COPD临床上一般表现为慢性咳嗽并伴有气促、喘息等症状，病情严重者出现食欲不振、体重下降、肌肉功能障碍和萎缩等全身性病症，甚至部分患者出现焦虑和抑郁现象〔12〕。目前临床上治疗COPD主要以减小气道炎症反应提高患者免疫，以减轻患者肺部感染和损伤。本研究结果提示COPD大鼠模型构建成功。仙鹤草在抗炎、调节免疫功能方面的药理作用受到广泛关注，研究发现不同浓度仙鹤草水煎液给药后，能显著提高环磷酰胺(CP)至免疫抑制小鼠白细胞数和脾脏指数，呈浓度依赖性，增强小鼠免疫功能〔13〕。临床用药发现，黄芪仙鹤汤治疗溃疡性结肠炎有效率高，服药后患者肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6水平明显降低，提示黄芪仙鹤汤有望在临床上推广使用〔14〕。本研究结果提示仙鹤草乙醇提取物有望成为治疗COPD的备选药物。

炎症反应伴随COPD病情进程，研究发现在COPD急性期小鼠鼠肺组织中，p-STAT3、p-JAK3表达水平显著升高，麦角固醇通过抑制JAK3/STAT3信号通路活性，下调IL-6、TNF-α、IL-1β水平，缓解COPD病症〔15〕。此外，许光兰等〔16〕研究发现，清金化痰颗粒能够下调p-STAT1、p-STAT3、IL-6水平，减轻COPD大鼠气道炎症。本研究结果提示仙鹤草能够抑制STAT3通路活性，缓解炎症反应。

CD4细胞参与机体自身免疫调控，主要由Treg细胞和Th17细胞亚群组成，Th17/Treg平衡在抗炎和机体免疫调节发挥重要作用〔17〕。Treg细胞能够分泌释放IL-10，以降低机体炎症反应，Foxp3是Treg细胞的特异性标志物，其持续高表达是维持Treg细胞活性的前提〔18〕。

本研究结果提示仙鹤草乙醇提取物能够上调Foxp3、IL-10表达水平，提高大鼠缓解炎症反应的能力。Th17细胞能够分泌释放IL-17，促进机体炎症反应，ROR-γt特异性调节Th17细胞转录，参与细胞因子诱导Th17细胞分化和炎症反应〔19〕。本研究结果说明COPD大鼠机体有炎症反应发生。仙鹤草乙醇提取物能够下调IL-17、ROR-γt表达水平，缓解COPD大鼠炎症反应。

综上，仙鹤草乙醇提取物可能通过抑制STAT3通路活性，上调Foxp3表达水平，下调ROR-γt表达水平，促进慢阻肺大鼠Th17/Treg平衡恢复，缓解炎症症状。但本研究样本量少，后续实验需扩大样本量深入研究调控机制。