中药复方膏剂呼吸道给药对昆明小鼠H22移植瘤的抑制作用

巨英超 张新飞 李星 刘亮

(河北医科大学第四医院 1实验动物中心，河北 石家庄 050011；2肺瘤研究所)

肝癌是常见的消化道恶性肿瘤，发病率及病死率较高〔1,2〕，严重威胁人们的生命健康。早期肝癌症状不明显，患者确诊时多为中晚期，已失去手术的最佳时期，往往会选择放化疗及介入治疗，但治疗效果均不佳。临床上寻找高效低毒的肝癌治疗方法具有重大意义。中药治疗肿瘤已有悠久的历史〔3～5〕，传统的中药服药方法多为口服，口服中药会对患者胃及肝脏造成损伤，寻找新的给药方式对于提高中药治疗肿瘤效果及降低毒副作用具有重要意义。呼吸道给药可以很好解决这些问题，而且易于患者接受，且呼吸道给药具有悠久的历史。本研究将中草药经过炮制后制成膏剂，采用中药膏剂呼吸道用药，治疗肝癌细胞昆明小鼠皮下移植瘤，观察中药呼吸道用药抑制肝癌皮下移植瘤生长作用，并初步研究药物对机体的毒副作用。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 CD4-FITC/CD8-FITC/CD3-PE 抗体购自美国Biolegend 公司；碘化丙啶染液购自美国BD公司； FC500型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司。

1.2药物主要成分配制和给药方式 取虫草1 g、甲珠15 g、 蜈蚣23条、 蝎子15 g、 丹参15 g、 桃仁15 g、 姜蚕15 g、 红花16 g、 山茨菇15 g、 白芥子15 g、 水牛角丝15 g、 枸杞子15 g、 甘草15 g， 经过炮制后制成中药药膏。吸入中药的给药方式：上述多种中草药经过炮制后制成的膏剂能散发气味，将50 g药物装入挥发管中，将膏状药物打孔确保挥发充分。将荷瘤小鼠放入口鼻暴露装置中，口鼻朝向挥发管，连接挥发管后打开仪器，使空气流向动物方向，携带药物散发的气体供动物吸入。

1.3实验动物 从河北省实验动物中心购买昆明小鼠20只，雌雄各半，体重16～20 g，许可证编号：SCXK(冀)2013-1-003。饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心屏障环境，空气洁净度为7 级，换气次数为15次/h，温度21～25℃，相对湿度45%～65%。

1.4模型的建立及分组 将鼠源性肝癌H22细胞接种至昆明小鼠腹腔，待形成腹水后，用20 ml注射器抽取腹水；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2遍后进行细胞计数，按5×106个/ml，接种0.2 ml细胞悬液至昆明小鼠右前肢肩甲处皮下。荷瘤小鼠随机分为两组(n=10)，每组雌雄各半，分笼饲养。中药组：将50 g药物装入挥发管中，将膏状药物打孔确保挥发充分，将荷瘤小鼠放入口鼻暴露装置中，口鼻朝向挥发管，连接挥发管后打开仪器，使空气流向动物方向，携带药物散发的气体供动物吸入，每天呼吸道给药1次，持续6 h，连续给药21 d；对照组：放置于与实验组相同的装置中，但管中没有中药，只通相同时间的空气。所有动物停药第2日(23 d)取材检测各项指标。实验期间每天观察小鼠一般状况，包括精神状态、饮食、饮水、排便及活动等，接种H22细胞7 d开始，每周测量移植瘤长短径及鼠重1次。

1.5标本采集及检测

1.5.1血液标本 腹腔注射2%戊巴比妥麻醉动物，经内眦取血，抗凝。

1.5.2肿瘤标本 脱颈处死动物，剥离皮下移植瘤，称重后，分别用70%乙醇和4%多聚甲醛固定，部分组织剥离后及时用网搓法制备成单细胞悬液。

1.5.3移植瘤生长抑制情况 移植瘤体积生长趋势：实验期间，每周测量瘤体最长径和最短径，计算瘤体积(瘤体积=长径×短径2/2)，比较各组移植瘤生长状况。计算肿瘤质量/体积抑制率：肿瘤质量/体积抑制率=(对照组肿瘤质量/体积-实验组肿瘤质量/体积)/对照组肿瘤质量/体积×100%。

1.6小鼠皮下移植瘤组织形态病理学检测 多聚甲醛(4%浓度)固定标本进行脱水，石蜡包埋，行常规病理切片，常规苏木素-伊红(HE)染色观察移植瘤组织形态。

1.7小鼠皮下移植瘤细胞凋亡及周期检测 取70%乙醇固定的移植瘤标本，利用网搓法制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/ml，取0.1 ml细胞悬液，加入碘化丙啶染液0.5 ml，染色30 min，PBS洗涤细胞1次，加入1 ml PBS，于流式细胞仪检测移植瘤细胞的DNA，Expo 32 ADC软件分析荧光数据，以亚二倍体细胞峰代表细胞凋亡峰计算细胞凋亡率；MultiCycle AV软件分析细胞周期，细胞增殖状态以增殖指数表示，增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.8荷瘤小鼠T细胞免疫功能检测 流式细胞术检测小鼠静脉血CD4+、CD8+及CD3+T淋巴细胞比例，停用药物第2日， 经小鼠内眦静脉取血0.5 ml，抗凝，取100 μl抗凝血，向其中分别加入10 μl CD4-FITC、CD8-FITC和CD3-PE 抗体， 室温避光放置30 min， 裂解红细胞后用流式细胞仪检测。

1.9统计学处理 采用SPSS11.5软件进行独立样本t检验。

2 结 果

2.1荷瘤小鼠一般情况和体重变化 中药组荷瘤小鼠一般状态良好，精神及活动正常，进食、饮水无明显变化，毛色光洁，体重变化平缓，无明显不良反应。对照组皮下移植瘤生长迅速，后期活动减少，进食、饮水无明显变化，体重持续增长，21 d、23 d对照组体重显著高于中药组(P<0.05)，见表1。其中第16 天两组各死亡 1 只荷瘤小鼠，均因肿瘤生长包裹颈部和面部引起窒息导致小鼠死亡。

表1 各组给药后不同时间体重比较

2.2昆明小鼠皮下移植瘤的生长抑制情况 23 d中药组皮下移植瘤体积显著小于对照组(P<0.05)，瘤体积抑制率为37.43%，中药组移植瘤质量〔(4.96±1.16)g〕显著低于对照组〔(7.79±2.33)g，P<0.01〕，瘤质量抑制率为36.33%。两组各时间点移植瘤体积见表2。

2.3昆明小鼠皮下移植瘤组织形态学观察 HE染色结果显示，中药组可见纤维组织增生，瘤细胞散在排列，瘤组织内坏死广泛分布，无明显区域性，瘤组织周围淋巴细胞浸润较多。对照组瘤组织坏死主要局限于中央区域，周边区域坏死较少，瘤细胞丰富，细胞间排列紧密，细胞异型性明显，大小不一，细胞核大小、形状和染色不一，病理性核分裂象多见。见图1。

图1 昆明小鼠皮下移植瘤组织形态学观察(HE,×200)

2.4两组皮下移植瘤细胞凋亡及细胞增殖的影响 中药组移植瘤细胞凋亡率〔(20.81±2.24)%〕显著高于对照组〔(13.22±3.27)%，P<0.01〕。中药组皮下移植瘤细胞增殖指数〔(55.26±2.34)%〕显著低于对照组〔(59.48±0.99)%，P<0.01〕。

2.5中药呼吸道用药对荷瘤小鼠免疫功能的影响 中药组荷瘤小鼠静脉血中CD3+、CD4+、CD8+T细胞比率〔(66.20±5.62)%〕、〔(48.23±6.99)%〕、〔(19.04±4.89)%〕与对照组〔(50.69±3.71)%〕、〔32.36±2.92)%〕、〔(13.58±2.28)%〕相比，显著增高(P<0.05)。中药组CD4/CD8 比值(2.73±1.02)高于对照组(2.44±0.43)，但无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

肝癌目前治疗方法包括手术、放化疗及介入治疗，但治疗效果均不佳。中药治疗肿瘤具有悠久的历史〔6～11〕，具有毒副作用低，价格低廉等优点。但传统的中药服药方法多为口服，口服中药会对患者胃及肝脏造成损伤〔12〕。呼吸道给药可以很好解决这些问题，而且易于患者接受〔13,14〕。呼吸道给药具有悠久的历史，《本草纲目》中记载用巴豆油纸拈，燃烟熏鼻，治疗中风痰厥、气厥、中毒等病症；汉代《伤寒杂病论》即开鼻药治疗急症之先河，其治“卒死”系以“韭捣汁，灌鼻中”，开窍回苏。呼吸道给药主要药物吸收部位在鼻腔和肺部，鼻腔深12～14 cm，中部鼻甲骨部膨大，鼻腔壁上有黏膜，鼻黏膜中有丰富的由静脉血管组成的海绵状组织或海绵体，鼻腔黏膜的表面积很大，大大增加药物吸收的有效表面积，鼻黏膜内有丰富的毛细血管，能使药物从鼻腔内吸收后直接进入体循环，而不经过门肝系统，避免了肝脏的首过效应；肺腔具有很大的吸收面积，具有丰富的毛细血管，又没有消化酶对药物的破坏。研究发现中药膏剂呼吸道给药可以抑制S180荷瘤小鼠的瘤体生长〔15〕。本研究结果提示中药组对小鼠皮下移植瘤具有生长抑制作用，其作用机制与提高小鼠T细胞免疫功能及诱导皮下移植瘤细胞凋亡相关。